[发明专利]人喉白斑上皮细胞三维培养模型的建立方法及其应用

说明书

本发明属于细胞培养技术领域，尤其涉及人喉白斑上皮细胞三维培养模型的建立方法及其应用。技术要点主要包括：白斑细胞原代培养；不定期检测细胞增殖；取培养至第三代或第四代的白斑细胞，制成细胞悬液；冰上操作，Matrigel基质胶中加入DMEM培养基制成稀释液，按照稀释液：细胞悬液为2：1的比例混合，得到新的细胞悬液，将新的细胞悬液按照每孔0.6ml加入至24孔板中；将24孔板转移至37℃细胞培养箱中培养12h后，各孔加入DMEM 1ml后继续培养1天即可。本发明在体外成功构建人白斑上皮细胞三维培养模型，构建方法简单，可操作性强，模型状态稳定。三维模型构建，成为二维细胞实验和在体细胞实验的桥梁。

技术领域

本发明属于细胞培养技术领域，尤其涉及人喉白斑上皮细胞三维培养模型的建立方法及其应用。

背景技术

声带白斑是一种常见的喉癌前病变，研究表明声带白斑在不同阶段都可能发生癌变，目前喉癌前病变多以声带白斑作为研究对象。

国外学者Lewin首次报道胃食管反流导致喉正常上皮组织向白斑转化可能与喉异型增生及喉癌的发生相关。国内也有研究发现咽喉反流与早期喉癌及声带白斑相关。但胃食管反流引起声带白斑的真正机制尚不清楚，以声带白斑为代表的喉癌前病变的发生、进展机制及寻找早期癌变特异性标志物，是亟待解决的临床问题。这对预防喉癌前病变发生癌变具有重要意义。

常规细胞培养以细胞二维贴壁培养为主，二维状态下所培养细胞与正常在体细胞无论从形态学、功能学、细胞对外界刺激生理特性等方面都存在显著差异。细胞培养技术极大地限制了学者对声带白斑的研究的发展。

目前国内、国际学者尚无针对白斑细胞进行三维培养模型构建相关报道，白斑细胞培养均为二维培养模型，二维模型细胞均为贴壁生长，与细胞在体状态存在明显差异，因此二维状态下所培养细胞与正常在体细胞无论从功能学、细胞对外界刺激生理特性等方面均存在显著差异。

再者目前部分学者提出三维培养其他细胞所使用基质胶为自主配制，自主配制基质胶存在性能不稳定性，操作繁琐性，以及配制过程污染性较高等弊端，使得培养过程无法顺利进行。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了人喉白斑上皮细胞三维培养模型的建立方法及其应用。

本发明是这样实现的，人喉白斑上皮细胞三维培养模型的建立方法，包括以下步骤：

步骤1：白斑细胞原代培养，取组织块，分离上皮细胞，去除成纤维细胞；

步骤2：不定期检测细胞增殖；

步骤3：取培养至第三代或第四代的白斑细胞，消化后制成细胞悬液；

步骤4：冰上操作，Matrigel基质胶中加入DMEM培养基制成稀释液；

步骤5：冰上操作，按照稀释液：细胞悬液为2：1的比例混合，得到新的细胞悬液，将新的细胞悬液按照每孔0.6ml加入至24孔板中；

步骤6：将24孔板转移至37℃细胞培养箱中培养12h后，各孔加入DMEM 1ml后继续培养1天即可。

进一步，步骤1中，喉白斑组织块用无菌D-Hank’S液反复冲洗。

进一步，步骤1中，组织块用D-Hank’S液反复冲洗后，用2.4mg/ml DispaseII浸没组织块。

进一步，步骤1中，用酶消化法分离上皮细胞。

进一步，步骤1中，消化液为胰酶和EDTA的混合物，具体配制方法为，配制质量浓度为0.25％的胰酶和0.02％的EDTA，并按照体积比1：1配制无菌混合消化液。

进一步，步骤2中，用CCK-8检测细胞增殖。