[发明专利]一种表达三肽酶的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法

说明书

本发明公开了一种表达三肽酶的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法，属于生物工程及基因工程领域。本发明首先克隆获得枯草芽孢杆菌三肽酶基因，并构建重组表达载体pMA5‑TAP，然后将其转化到枯草芽孢杆菌WB600中，获得重组枯草芽孢杆菌WB600/pMA5‑TAP，用该重组菌株能高效表达三肽酶，经过摇瓶初步优化后，发酵液上清中的酶活为25.63U/mL，为工业化生产三肽氨肽酶奠定了基础。

技术领域

本发明涉及一种表达三肽酶的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

三肽酶(TAP，M20.003)又称三肽氨肽酶，是一种主要切割小分子三肽的氨肽酶，可以识别小分子三肽，从多肽链的N端开始切割氨基酸残基的氨肽酶。三肽酶可以应用于大豆蛋白水解液脱苦。大豆蛋白水解液中主要苦味物质是小分子多肽，有文章报道，主要苦味肽分子量是在200-1400Da，苦味肽链为2-3个氨基酸到十几个氨基酸。通过加入三肽酶可以更加有效水解苦味小分子肽，同时产生一些鲜味肽，并且不影响其他大豆多肽的功能。三肽酶可以有效抑制大豆蛋白水解液的苦味，起到抑苦增鲜的作用，在食品大豆蛋白加工中具有重要应用价值。

枯草芽孢杆菌是革兰氏阳性菌，无致病性、不产内毒素及热源性物质，是美国食品药物管理局(FDA)和中国农业部等部门认证的食品级安全菌株。作为公认安全微生物用枯草芽孢杆菌表达的产物作为食品添加剂或制备风味食品更安全，且枯草芽孢杆菌遗传背景研究较清楚，无明显的密码子偏好性，表达的外源蛋白不易形成包涵体，枯草芽孢杆菌具有很强的蛋白分泌能力，枯草芽孢杆菌细胞膜只有一层，可更容易地将目的蛋白直接分泌到胞外，简化了纯化目的蛋白的步骤，适宜大规模的生产。故枯草芽孢杆菌表达系统受到了研究者们广泛关注并开展深入研究，目前枯草芽孢杆菌表达系统已成功表达数以千计的蛋白基因，成为一个重要的基因工程模式菌株。

目前国内对三肽酶的研究报道几乎没有，因此，提供一种制备三肽酶的方法，对于其在工业上的应用和研究有重要的价值。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种重组枯草芽孢杆菌，其表达氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示的三肽酶。

在本发明的一种实施方式中，编码所述三肽酶的基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

在本发明的一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌的宿主包括枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis，B.subtilis)WB600；重组枯草芽孢杆菌的表达载体包括pMA5。

本发明的第二个目的是提供上述重组枯草芽孢杆菌的构建方法，包括以下步骤：

(1)合成三肽酶基因；

(2)将三肽酶基因连接到表达载体上，获得重组质粒；

(3)将重组质粒转化至枯草芽孢杆菌中表达。

在本发明的一种实施方式中，所述转化包括化学转化法。

本发明的第三个目的是提供上述重组枯草芽孢杆菌在三肽酶生产中的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述应用包括以下步骤：

(1)挑取活化的重组枯草芽孢杆菌单菌落接种于LB培养基中培养；

(2)吸取步骤(1)中得到的培养液，加入到发酵培养基中发酵，进行表达；

(3)将步骤(2)中获得的发酵液离心收集上清，即为三肽酶胞外粗酶液。

在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中所述的发酵是在35-39℃、200-220rpm条件下培养16-24h。