[发明专利]一种神经球免疫荧光染色的方法

说明书

本发明公开了一种神经球免疫荧光染色的方法：(1)神经球清洗：取悬浮培养的神经球，离心，弃上清，重悬神经球，再次离心，弃上清；(2)固定；(3)通透及封闭；(4)一抗孵育；(5)漂洗；(6)二抗孵育；(7)漂洗；(8)封片：加入PBS缓冲液，重悬，滴加于载玻片上，滴加抗荧光淬灭剂，加盖盖玻片，将神经球压平封片，用于荧光显微镜观察。本发明利用神经球直径大、肉眼可见的特性，直接采用低速离心将细胞收集管底，避免神经球在染色过程中丢失，能够保持神经球原有细胞形态及内部结构，有效避免细胞爬片过程中造成的的抗原特性改变；采用物理挤压法直接对神经球进行压片，将神经球挤压成薄膜状，无需进行切片，对设备要求低。

技术领域

本发明涉及一种神经球免疫荧光染色的方法，属于分子生物学技术领域。

背景技术

神经干细胞是指具有分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的能力，能自我更新并能提供大量脑组织细胞的细胞群。神经干细胞多采用悬浮神经球培养的方法来获得和研究。

免疫荧光技术是将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体(或抗原)上，与其相应的抗原(或抗体)结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应，从而进行组织或细胞内抗原物质的定位。

神经球的免疫荧光染色通常先对神经球进行细胞爬片或冰冻切片，使神经球固定在玻璃载体上，再进行染色，步骤复杂，成本高，对人员的专业要求高。且细胞爬片制作过程中存在细胞贴壁困难，易改变抗原特性干扰实验结果等缺点；冰冻切片制作存在设备要求高、容易卷片、脱片等缺点。

中国发明专利CN 102288471 A公开了一种悬浮细胞的免疫荧光染色方法，该方法适用于悬浮细胞，但对神经球的免疫荧光染色存在不足,原因为：首先，神经球直径比较大，用该方法进行染色时仅能染神经球表层细胞，神经球内部细胞无法成功染色；其次，该方法容易造成细胞裂解，对于神经球而言，破坏了原有细胞形态及内部结构，从而影响染色结果，实际应用价值不高。中国发明专利CN 105424450 A公开了一种悬浮细胞球免疫荧光染色方法及染色装置，该方法适用于悬浮细胞球，该方法对细胞球免疫荧光染色需要借助特殊的染色装置，一般实验室较难满足；该方法通透和封闭分别进行，耗费时间；该方法的封闭液为山羊血清，封闭效果较差，容易造成非特异。

发明内容

针对上述现有技术的不足之处，本发明提供了一种神经球免疫荧光染色方法，该方法不用进行神经球细胞爬片或者冰冻切片，可以直接对培养中的神经球进行染色，染色过程中不易造成细胞裂解，能很好地保持原有神经球的完整性及抗原特性，无需特殊装置，节省时间，染色效果好，特异性强。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种神经球免疫荧光染色的方法，包括以下步骤：

(1)神经球清洗：取悬浮培养的神经球，置于1.5ml离心管中，离心，弃上清，加入PBS缓冲液重悬神经球，再次离心，弃上清；

(2)固定：加入固定剂，轻柔混匀，室温静置30分钟，每5分钟轻弹管底，使神经球与固定液充分接触，离心，弃上清；

(3)神经球通透及封闭：加入通透及封闭液，摇床上孵育30～60分钟，然后离心，弃上清；所述通透及封闭液，是由6％BSA溶液与1％Triton X-100溶液等体积混合而成；

(4)一抗孵育：加入适当稀释的一抗，并轻柔混匀，4℃环境下孵育8～12小时，离心，弃上清；

(5)漂洗：加入PBST(即：含有0.5％Triton X-100的PBS溶液)重悬神经球，摇床清洗10分钟，离心，弃上清；重复若干次，比如3次；

(6)二抗孵育：加入适当稀释的二抗，轻柔混匀，摇床孵育3小时，离心，弃上清；

(7)漂洗：加入PBST重悬神经球，摇床清洗10分钟，离心，弃上清；重复若干次，比如3次；