[发明专利]一种基于三维微载体细胞复苏的方法

说明书

本发明公开了一种基于三维微载体细胞复苏到新载体进行生长繁殖的方法。本发明提供一种基于三维微载体的细胞复苏方法，包括如下步骤：将冻存细胞或冻存细胞微组织复溶后的细胞悬液接种至三维微载体上进行细胞复苏培养。该方法可实现细胞传代不再打断三维培养的过程，从而在制备三维培养的细胞制品或组织工程产品时，全程保持细胞处于三维状态。可以实现全封闭式的细胞培养和连续扩增。以期在细胞复苏的领域提供一些创新或补充或经验。

技术领域

本发明涉及细胞冻存复苏培养领域，具体涉及一种基于三维微载体细胞复苏到新载体进行生长繁殖的方法。

背景技术

在细胞培养扩增过程中，细胞冻存及复苏在细胞保种长途运输方面有着重要的意义。随着培养时间的延长和细胞不断分裂，培养表面逐渐长满细胞，细胞之间相互接触会发生接触性抑制，生长速度减慢甚至停止。对于重要的细胞需要保存留种，或长途运输转移细胞时，通过冻存可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存下来，待需要时重新复苏，可以使冻存的细胞重新恢复生命力而继续完成后续细胞使命。

通常的细胞冻存复苏流程是将细胞从培养基底上收获下来(消化)，在冻存保护剂保护下低温(比如-70℃、-196℃)冷冻保存，需要时将细胞快速复融，一般在37℃恒温水浴复融(称为复苏)。复融的细胞接种到培养基底上进行细胞生命活动的恢复和细胞的生长繁殖。目前，对于贴壁细胞来说，冻存的细胞一般是复苏到二维的培养基底上，如细胞培养瓶，细胞培养皿等。

目前研究表明三维培养要比二维培养能够更好地维持细胞的功能，使其更似体内的细胞，而二维培养使细胞脱离了体内原有的环境，细胞出现多种与体内不一致的现象，导致培养出来的细胞在下游应用上出现不良效果，比如药物筛选结果不准确，或失去活性无法用于体内治疗。然而，三维培养比二维培养来的复杂，因此要保证细胞活力及足够的细胞数目才能够成功地进行三维培养。而一般认为刚复苏的细胞较为脆弱，不宜进行太复杂的操作或在复杂环境中培养，如此一来，三维培养的复杂性是对复苏细胞的一种挑战。因此，多数情况下，三维培养的细胞来源一般是从二维基底上收获下来的新鲜有活力的细胞。然而，在培养前需要把细胞复苏至二维的培养基底后，进行二维培养再收获下来接种至三维培养的基底上，就让细胞无法从最起始就以更似体内的三维培养环境进行培养。不仅如此，对于想利用三维培养进行大规模生产细胞的应用，其关键问题在于这个复苏过程在量化生产中会浪费大量的时间和成本。因此，实现冻存的细胞直接复苏接种到三维的基底上进行培养可以解决这些问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种冻存细胞或微组织直接复苏接种于三维微载体的细胞培养方法。

本发明要求保护一种基于三维微载体的细胞复苏方法，包括如下步骤：将冻存细胞或冻存细胞微组织复溶后的细胞悬液接种至三维微载体上进行细胞复苏培养。

所述冻存细胞微组织为冻存于三维微载体的细胞。冻存的每mg微组织上有0.1-25×10⁶个细胞。本发明的实施例中，每mg微组织上有0.25×10⁶个细胞。

所述基于三维微载体的细胞复苏方法可以为基于三维微载体的动态细胞复苏方法，包括如下步骤：

(A1)取三维微载体置于细胞培养容器内，加入细胞培养基，立刻进行下一步操作或进行处理1min以上；所述处理方法为静置或搅拌；

(A2)取冻存细胞或冻存细胞微组织于37℃复溶后的细胞悬液接种至(A1)制备的含有微载体的细胞培养容器内，然后加入细胞培养基调整微载体与培养基的比例至1mg：1～1000μL；将所述细胞培养容器置于搅拌器上并放入培养箱中进行搅拌；

(A3)完成(A2)后，继续搅拌培养细胞至完成细胞复苏。

所述步骤(A1)中，加入细胞培养基后可静置处理1-10min。本发明的实施例中，静置处理时间为10min。