[发明专利]一种提高酿酒酵母橙花叔醇产量的方法

权利要求书

1.一种提高酿酒酵母橙花叔醇产量的方法，其特征在于所述方法为：在敲除Gal80基因的酿酒酵母CEN.PK2-1D中，使用Gal启动子驱动甲羟戊酸途径代谢酶和橙花叔醇合成酶的表达形成二次生长诱导系统，同时过表达转录因子hac1基因，构建得到合成橙花叔醇的酵母工程菌；所述转录因子hac1基因核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示；

所述使用Gal启动子驱动甲羟戊酸途径代谢酶的方法为：第一步使用Gal启动子高表达3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶HMGR和法尼烯焦磷酸合成酶ERG20；第二步用Gal启动子高表达甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶MVD1、磷酸甲羟戊酸激酶ERG8和异戊烯焦磷酸异构酶IDI1，敲除rox1基因；第三步用Gal启动子高表达3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶HMGR、3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶ERG13和甲羟戊酸激酶ERG12，敲除yp1062w位点；第四步用Gal启动子高表达3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶ERG13、甲羟戊酸激酶ERG12和异戊烯焦磷酸异构酶IDI1，并使用HXT1基因的启动子替换基因组上Erg9基因的启动子；第五步用Gal启动子高表达3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶HMGR、乙酰辅酶A乙酰转移酶ERG10和3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶HMGR，敲除bts1基因；第六步用FBA1启动子高表达乙酰辅酶A合成酶ACS、Gal启动子高表达丙酮酸脱羧酶PDC和乙醛脱氢酶Ada、HXT7启动子高表达醇脱氢酶ADH2，敲除adh1基因；

所述橙花叔醇合成酶的表达方法为：来源于猕猴桃(Actinidia chinensis)的橙花叔醇合成酶AcNES1，通过将SEQ ID NO.2所示编码基因AcNES1克隆至pYES2载体GAL1启动子后，导入酿酒酵母进行表达；

所述hac1基因的过表达按如下方法进行：将Hac1基因与TDH3启动子整合到基因组位点YPRCtau3，或者使用TDH3启动子在pRS316质粒上组成型过表达Hac1。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述酿酒酵母工程菌培养方法为：将酿酒酵母工程菌接种至葡萄糖合成最小培养基，在30℃、摇瓶转速200rpm下培养过夜，取培养物接种至18mL蔗糖合成最小培养基，使得初始OD₆₀₀达到0.2，再加入2mL十二烷，在30℃、摇瓶转速200rpm条件下培养96h，培养物离心，得到含有橙花叔醇的十二烷有机相；所述葡萄糖合成最小培养基质量终浓度组成：2％葡萄糖，0.17％酵母氮源，0.5％硫酸铵和微量营养素，溶剂为蒸馏水，pH 5.0；其中微量营养素是指色氨酸、组氨酸、亮氨酸和尿嘧啶，它们在培养基中的终浓度均为20mg/L；所述蔗糖合成最小培养基是将葡萄糖合成最小培养基中的2％葡萄糖替换为2％蔗糖。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于微量营养素为组氨酸。