[发明专利]一种提高酿酒酵母橙花叔醇产量的方法

说明书

本发明公开了一种提高酿酒酵母橙花叔醇产量的方法，所述方法为：在敲除Gal80基因的酿酒酵母中，使用Gal启动子驱动甲羟戊酸途径代谢酶和橙花叔醇合成酶的表达形成二次生长诱导系统，同时过表达转录因子hac1基因，构建得到合成橙花叔醇的酵母工程菌。本发明使用酵母二次生长诱导系统进行代谢改造，当GAL启动子驱动的表达盒大量整合在基因组上后，GAL启动子的转录活性大幅度下降，而本发明中过表达转录因子Hac1则可以提高GAL启动子的转录活性和菌株活力，进而促进二次生长诱导系统中目标代谢产物的合成，橙花叔醇产量提高了48.4％，达到497mg/L。

(一)技术领域

本发明涉及一种提高酿酒酵母橙花叔醇产量的方法。

(二)背景技术

酿酒酵母具有遗传操作简便、生物安全性高和发酵稳定等优点，是一种应用广泛的生物细胞工厂。萜类化合物的通用C5前体为异戊烯基焦磷酸(IPP)和二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)，它们在酵母中通过甲羟戊酸(MVA)途径合成。通过提高乙酰-COA和MVA水平，研究者已经成功地将酿酒酵母改造为异源生物合成萜类化合物的高产微生物。橙花叔醇是一种芳香的倍半萜精油成分，广泛应用于化妆品和洗涤。此外，橙花叔醇还具有抗病毒、抗肿瘤和抗疟疾的作用。本发明以酵母工程菌中橙花叔醇的合成为例，为提高酵母倍半萜的生产提供了一种新的方法。

在代谢工程中，加强代谢途径通量可能导致细胞产生代谢压力或对细胞有毒性的中间代谢物。为了解决这个问题，研究者设计了基于酵母GAL启动子的二次生长诱导系统，在该系统中，敲除GAL80基因的菌株，GAL启动子在培养基中糖耗尽后开始转录，无需半乳糖诱导。该系统成功地将细胞生长和产物积累阶段分离，减轻了产物对菌体的毒性。

然而，酵母细胞工厂中重组蛋白或代谢酶的过表达，仍然会导致细胞蛋白负荷增大，使得菌体的比生长速率下降，发酵启动延迟，发酵产量降低，或生物量降低。酵母已经进化出一些细胞应激防御策略，以减轻蛋白质负荷压力。众所周知的调节策略之一涉及在未折叠蛋白反应中起重要作用的转录因子Hac1p。错误折叠的膜蛋白或分泌蛋白在内质网中的积累，会诱导Hac1p转录物的进一步剪接，后者调节未折叠蛋白反应靶基因的转录。未折叠蛋白反应靶基因编码参与蛋白质折叠的分子伴侣、蛋白质降解、糖基化和脂质代谢。Hac1在毕赤酵母中的过表达已经成为增强分泌异源蛋白表达的常用策略。

在目前所有文献的报道中，Hac1参与调控的未折叠蛋白反应，是由错误折叠的膜蛋白或分泌蛋白在内质网中的积累引发。而代谢工程中往往将代谢酶基因在细胞质中表达，似乎与Hac1的功能无关。然而，在本发明中，我们发现随着整合在基因组上的GAL启动子驱动的基因表达盒的数量不断提高，二次生长诱导系统中目的产物代谢途径的酶基因的转录水平会大幅度下降。可以通过高表达Hac1，增强二次生长诱导系统中，由Gal启动子驱动的代谢途径中酶基因的转录水平，从而进一步增强目的代谢产物的合成。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种提高酿酒酵母代谢工程菌的橙花叔醇产量的方法，使用现有的酵母二次生长诱导系统进行代谢改造，当GAL启动子驱动的表达盒大量整合在基因组上后，GAL启动子的转录活性大幅度下降，而本发明中利用组成型启动子过表达转录因子hac1则可以提高GAL启动子的转录活性，进而促进二次生长诱导系统中目标代谢产物的合成。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种提高酿酒酵母橙花叔醇产量的方法，所述方法为：在敲除Gal80基因的酿酒酵母中，使用Gal启动子驱动甲羟戊酸途径代谢酶和橙花叔醇合成酶的表达形成二次生长诱导系统，同时过表达转录因子hac1基因，构建得到合成橙花叔醇的酵母工程菌。通过过表达转录因子hac1基因，进一步提高酿酒酵母工程菌橙花叔醇的产量。