[发明专利]一种用于催化制备非天然氨基酸的苯丙氨酸脱氢酶及其应用

说明书

本发明公开了一种用于催化制备非天然氨基酸的苯丙氨酸脱氢酶及其应用，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1、2、3或4所示。本发明通过对获得自海洋菌株Bacillus nanhaiensis(CGMCC NO.8969)的苯丙氨酸脱氢酶进行C末端区域改造，获得的变体氨基酸脱氢酶可催化系列非天然氨基酸底物，提高其催化具有大疏水基团的非天然氨基酸的能力，扩展底物谱。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种用于催化制备非天然氨基酸的苯丙氨酸脱氢酶及其应用。

背景技术

手性氨基酸，包括天然氨基酸和非天然氨基酸，是合成手性药物、手性农药和手性食品添加剂等精细化学品的关键中间体。例如，D-苯甘氨酸是β-内酰胺类半合成抗生素的重要中间体，作为氨苄青霉素、匹夫氨苄等的重要侧链，市场前景广阔。L-苯基丁氨酸(L-Homophenylalanine)，即(S)-2-氨基-4-苯基丁酸是一种非天然的手性α-氨基酸，该氨基酸是20种全球已上市的抗高血压药物血管紧张素抑制剂普利类药物，例如贝那普利、西拉普利、赖若普利、依那普利、地那普利及卡托普利等用于治疗高血压和各种心血管疾病的血管紧张素转换酶抑制剂普利类药物合成的共同手性中间体，作为常见的结构单元起着中心药效基团的作用。年需求量约1000吨且逐年递增。制备大位阻非天然氨基酸主要通过化学合成法和酶催化法。化学合成法存在诸多不足，反应过程复杂；反应条件苛刻；生成成本高；环境污染严重等。酶催化法具有高立体选择性，生产过程简单，反应安全等优势。

氨基酸脱氢酶催化可逆的氨基酸氧化脱氨和酮酸的不对称还原胺化反应。通过对氨基酸脱氢酶的分子改造，可拓展其催化功能用于生物合成系列非天然氨基酸。具有大位阻疏水侧链的手性非天然氨基酸是生物催化合成的技术难点。研究表明发现突变之后的氨基酸脱氢酶底物结合口袋发生了重塑，不仅可以容纳这些大位阻底物，同时拉近了底物与辅酶之间的催化距离，使其获得对大位阻底物的催化活性。但是，对具有大位阻芳香基团侧链和环烷基侧链的底物酮，目前无论是通过基因改造获得的基因工程氨基酸脱氢酶还是筛选获得的天然氨基酸脱氢酶催化活性均较低。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种用于催化制备非天然氨基酸的苯丙氨酸脱氢酶及其应用。

本发明的技术方案如下：

一种用于催化制备非天然氨基酸的苯丙氨酸脱氢酶，其氨基酸序列如SEQ IDNO.1、2、3或4所示，其原始序列来源于海洋菌株Bacillus nanhaiensis(CGMCC NO.8969)的苯丙氨酸脱氢酶。

在本发明的一个优选实施方案中，其催化体系包括：将底物和NAD⁺溶解于pH＝9-11的甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液中，接着加入10-30％的助溶剂，使得底物的浓度为10～500mM，然后加入权利要求1所述的苯丙氨酸脱氢酶的酶液至该苯丙氨酸脱氢酶浓度为20-200U/L，于10-70℃并搅拌条件下进行反应10-100h。

进一步优选的，其催化体系包括：将底物、甘油和NAD⁺溶解于pH＝9-11的甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液中，接着加入10-30％的助溶剂，使得甘油的浓度为0.5-3M，NADH浓度为0.2-20mM，底物的浓度为10～500mM，然后加入所述苯丙氨酸脱氢酶的酶液和甘油脱氢酶的酶液至该苯丙氨酸脱氢酶和该甘油脱氢酶的浓度分别为20-200U/L和50-150U/L，于10-70℃并搅拌条件下进行反应10-100h。

更进一步优选的，所述助溶剂为十二烷基硫酸钠、吐温-80、吐温-60、司盘-80、司盘-60、甲醇、乙醇、异丙醇、正丁醇、四氢呋喃、二甲基亚砜、乙酸乙酯、甲基叔丁基醚、乙醚、甲苯、二氧六环、石油醚、正戊烷、环戊烷、正己烷、环己烷和正庚烷中的至少一种。

再进一步优选的，所述甘油脱氢酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.05所示，其来源于Klebsiella pneumoniae。