[发明专利]一种山羊SLAM基因的克隆与原核表达方法

权利要求书

1.一种山羊SLAM基因的克隆与原核表达方法，其特征在于：具体方法如下：

S1、通过GenBank获得山羊SLAM基因和氨基酸序列，根据编码细胞外结构域的SLAM基因片段设计特异性引物，并通过RT-PCR方法获得SLAM基因片段；

S2、SDS-PAGE电泳检测PCR产物，将扩增的山羊SLAM基因片段克隆到PET SUMO载体中，并通过DNA测定序列，构建阳性重组质粒PET SUMO-SLAM；

S3、将阳性重组质粒PET SUMO-SLAM转化到感受态Rosetta细胞中；

S4、将转化的细胞在含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基平板中于37℃培养；

S5、将含有构建的质粒的新转化的大肠杆菌的单菌落在含有50μg/mL卡那霉素的3mlLB液体培养基中培养，并在37℃温育直至600nm处的OD值达到0.6；

S6、IPTG诱导融合蛋白的表达，然后通过Ni亲和层析纯化得到SLAM重组蛋白，纯化后，用滴定法对包合蛋白进行复性，然后通过SDS PAGE分析。

2.根据权利要求1所述的一种山羊SLAM基因的克隆与原核表达方法，其特征在于：在步骤S1中SLAM基因序列为：CTGACCAGCAGCACCAAAACCATTCGTGGTCAGCTGGGTAGCAGCGTTCTGCTGCCGCTGGCAAGCGAAGAAATTAGCCGTAGCATGAATAAAAGCATCCATATTCTGGTTACCATGGCAGAAAGTCCGCGTGATACCGTTAAAAAGAAAATTGTTAGCCTGGATCTGCGCAAAGGTGATAGTCCGCGTCTGGAAGATGGTTATGAATTTCATCTGGAAAATCTGAGCCTGCGCATTCTGAAAAGCCGTAAAGAAGATGAAGGCTGGTATTTCATTTCCCTGGAAGAAAATGTGTCCGTGCAGCATTTTAGCCTGCAGCTGAAACTGTATGAACAGGTTAGCACACCGCAGATTAAAGTTCTGAATAGCACCCAAGAAGATGGTAATTGTAGCCTGATGCTGGCATGTGTTGTTGAAAAAGGTGATCACGTTACCTATAATTGGAGCGAAGAAGCAGGCGCACCGCTGCTGAGCCCGACCAATAGCAGCCATCTGCTGTATCTGACCCTGGGTCCGCAGCATGCAAATAATGTGTATATTTGTATTGCGAGCAACCCGATTAGCAATAGCAGTCAGACCTTTATTCCGTGGTCACGTTGTAGCAGCCGTCCGCCTGAAAGCCGTCAG。

3.根据权利要求1所述的一种山羊SLAM基因的克隆与原核表达方法，其特征在于：在步骤S1中SLAM基因氨基酸序列为：LTSSTKTIRGQLGSSVLLPLASEEISRSMNKSIHILVTMAESPRDTVKKKIVSLDLRKGDSPRLEDGYEFHLENLSLRILKSRKEDEGWYFISLEENVSVQHFSLQLKLYEQVSTPQIKVLNSTQEDGNCSLMLACVVEKGDHVTYNWSEEAGAPLLSPTNSSHLLYLTLGPQHANNVYICIASNPISNSSQTFIPWSRCSSRPPESRQ。

4.根据权利要求1所述的一种山羊SLAM基因的克隆与原核表达方法，其特征在于：在步骤S1中所设计的引物包括上游引物5’ATGCTCTCCTTGAATGTCCTGCTGT3’和下游引物5’TTATTGTCTTGATTCTGGGGGCCTG3’。

5.根据权利要求1所述的一种山羊SLAM基因的克隆与原核表达方法，其特征在于：在步骤S1中RT-PCR方法为用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA为模板，逆转录形成cDNA第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。

6.根据权利要求1所述的一种山羊SLAM基因的克隆与原核表达方法，其特征在于：在步骤S6中利用镍亲和色谱法对融合蛋白表达进行大量诱导和纯化。