[发明专利]一种山羊SLAM基因的克隆与原核表达方法

说明书

本发明公开了一种山羊SLAM基因的克隆与原核表达方法，具体涉及小反刍兽疫病毒(PPRV)检测技术领域，具体方法如下：S1、获得山羊SLAM基因和氨基酸序列，设计特异性引物，通过RT‑PCR方法获得SLAM基因片段；S2、将扩增的SLAM基因片段克隆到PET SUMO载体中，构建阳性重组质粒PET SUMO‑SLAM；S3、将阳性重组质粒PET SUMO‑SLAM转化到感受态Rosetta细胞中；S4、将转化的细胞在LB培养基平板中培养；S5、将含有构建的质粒的新转化的大肠杆菌的单菌落在LB液体培养基中培养；S6、IPTG诱导融合蛋白的表达，然后通过SDS PAGE分析。本发明为PPRV抗原检测提供一种捕获蛋白，用于开发PPRV抗原检测试剂盒，从而用于检测PPRV病毒，使得检测方法具有更好的特异性和灵敏性。

技术领域

本发明涉及PPRV病毒检测技术领域，更具体地说，本发明涉及一种山羊、绵羊SLAM基因的克隆与原核表达方法。

背景技术

小反刍兽疫(Peste des Petits Ruminant，PPR)是由PPR病毒(PPRV)引起的一种急性、热性和高度传染性的跨境动物疫病，临床上以发热、口腔炎、结膜炎、肠胃炎和肺炎为特征。PPRV为副粘病毒科(Paramyxoviridae)麻疹病毒属(Morbillivirus)的成员，其基因组是不分节段的单股负链RNA，长度约16KB，RNA链从3′至5′依次是N-P-M-F-H-L 6个基因，在结构和遗传上，PPRV与牛和水牛的牛瘟病毒(RPV)、人类的麻疹病毒(MeV)、狗瘟热病毒和一些野生食肉动物以及水生哺乳动物的麻线病毒密切相关。虽然这种病毒的主要宿主是山羊和绵羊，但山羊似乎比绵羊更容易受到感染。据报道，牛，水牛，骆驼和猪也会发生亚临床感染，但在该病的传播方面不发挥任何作用。此外，PPRV对其他不寻常的宿主如骆驼、瞪羚、北山羊、大羚羊、鹿、羚羊、野山羊和猪的感染已经给疾病的根除带来巨大挑战。该疾病的发病率和死亡率可分别达到100％和90％。

PPRV于1942年首次在西非的科特迪瓦(科特迪瓦)报道，目前，该病已在中非和东非，中东，土耳其，中国，印度和尼泊尔流行蔓延，尤其在摩洛哥、土耳其和格鲁吉亚的疫情报道，预示PPR已进入欧洲门户，如果不加控制，它将进一步蔓延，给数百万的农牧民带来巨大的损失和困难，每年的经济损失估计高达21亿美元.因此,世界动物卫生组织和联合国粮农组织制定了2030年PPR全球根除计划，为了实现这一目标，有效的诊断工具对于及时诊断疾病起着至关重要的作用，最初开发了琼脂凝胶免疫扩散试验(AGID)/AGPT、反向免疫电泳(CIE)、点酶免疫试验和组织免疫组织化学染色等，但这些诊断方法缺乏灵敏度、可靠性不理想。近年随着生物学技术的发展，建立了病毒分离、常规RT-PCR，RT-qPCR，RT-环介导等温扩增(LAMP)等灵敏度高的先进技术，然而，这些方法需要专门的设备和技术人员来进行操作。为了克服这些问题，快速、灵敏的ELISA可能是检测病毒抗原的有效潜在方法。

信号淋巴激活因子(Signaling lymphocyte activation molecule，SLAM又称CD150)是Tatsuo等在2000年发现的麻疹病毒属麻疹病毒(MV)入侵细胞所需的主要受体之一。该病毒属还包括有PPRV、犬瘟热病毒(CDV)和牛瘟病毒。目前已经发现的MV受体有CD46、SLAM以及Nection-4。SLAM属于免疫球蛋白家族CD2成员，在分子结构上包含两个高度糖基化的免疫球蛋白超家族结构域，一个V型和一个C2型免疫球蛋白样(Ig-like)结构域，位于N端的V结构域与MV血凝素蛋白的结合介导病毒入侵细胞。SLAM也是PPRV入侵感染细胞所需的主要细胞受体，能特异地结合PPRV，因此，可以利用SLAM受体作为抗原捕获配体，研制用于检测PPRV的改进的新型诊断工具。据报道，人类SLAM细胞外结构域的V结构域足以与麻疹病毒结合，并且表明山羊SLAM的V结构域可足以与PPRV的H和F蛋白相互作用，因此，在本发明目的在于克隆与表达山羊SLAM基因，纯化表达重组蛋白作为捕获配体以检测PPR病毒。

发明内容