[发明专利]一种马铃薯StRab5b基因的克隆、载体构建和瞬时表达的研究方法

权利要求书

1.一种马铃薯StRab5b基因的克隆、载体构建和瞬时表达的研究方法，其特征在于：包括以下步骤：采用感染晚疫病菌的烟草叶片，通过①查找马铃薯StRab5b的基因序列，设计克隆和构建载体所用的引物，对马铃薯的StRab5b基因进行克隆；对马铃薯的StRab5b基因克隆后，用载体pCAMBIA1300-221，构建出表达载体PCAMBIA1300-221-StRab5b-GFP；

②采用步骤①构建出的表达载体

PCAMBIA1300-221-StRab5b-GFP注入烟草叶片中，观察表达载体PCAMBIA1300-221-StRab5b-GFP在烟草叶片中的瞬时表达，以评估上述表达载体抗烟草晚疫病的抗菌情况；

所述步骤①所述的对马铃薯的StRab5b基因进行克隆，构建出表达载体PCAMBIA1300-221-StRab5b-GFP的方法包括以下步骤：a、对马铃薯的StRab5b基因进行克隆后，利用高保真酶HS DNA Polymerase扩增马铃薯的StRab5b基因，回收扩增后马铃薯的StRab5b基因片段；将扩增后马铃薯的StRab5b基因片段与平末端载体Simple Cloning Vector连接后转入大肠杆菌DH5α并进行涂平板操作，涂平板后挑出大肠杆菌DH5α的阳性菌落并提取质粒，保存大肠杆菌DH5α菌液和质粒备用；

b、利用BglII和KpnI双酶切PLG-Rop重组质粒后获得PLG片段，BglII和KpnI双酶切的步骤a中StRab5b基因片段与平末端载体Simple Cloning Vector连接的重组质粒后获得StRab5b片段，PLG片段与StRab5b片段连接后形成PLG-StRab5b片段后转入大肠杆菌；

c、利用XbaI和SacI双酶切的步骤b获得的PLG-StRab5b重组质粒后获得GFP-StRab5b片段并回收，XbaI和SacI双酶切pCAMBIA1300-221载体后获得载体大片段，GFP-StRab5b片段与载体大片段连接后获得pCAMBIA1300-221-GFP-StRab5b重组质粒后转入大肠杆菌，挑取阳性菌落后提取质粒，酶切鉴定后转入农杆菌GV3101中保存；

所述马铃薯StRab5b基因如下：

步骤②所述的表达载体pCAMBIA1300-221-StRab5b-GFP注入烟草叶片中的方法包括以下步骤：I、将在卡那霉素和利福平抗性的YEB培养基上划线培养的含有pCAMBIA1300-221-StRab5b-GFP、pCAMBIA 1300-221-GFP的农杆菌接种在10mlYEB液体培养基中，振荡培养过夜；

II、步骤I所述的YEB液体培养基振荡培养过夜结束后，在转速8000rpm的条件下离心2min，收集菌体；

III、用含有150μM乙酰丁香酮、10mM MgCl₂、10mM MES的混合液体重悬步骤II所收集的菌体后得到菌液，测定菌液的OD₆₀₀值为0.5-0.6时备用；

IV、用无针头的注射器吸取步骤III得到的菌液，并将菌液均匀注入到烟草叶片背面右侧，在21℃温度下培养24h；

V、在烟草叶片的背面右侧接种在4℃条件下诱孢4h的晚疫菌，左侧接种H₂O；

VI、然后将接种后的叶片置于21℃，80％湿度的培养箱中培养并观察若干天后发病情况。

2.根据权利要求1所述的一种马铃薯StRab5b基因的克隆、载体构建和瞬时表达的方法，其特征在于：步骤a所述马铃薯的StRab5b基因克隆的方法是：通过Trizol的方法提取马铃薯组培苗底西瑞的RNA，用Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit获得cDNA，用Primer5.0软件设计克隆和构建载体所用的引物；所述的用Primer5.0软件设计的引物为：

Rab5b-F：5′-GAAGATCTTCATGGG TTGCGCATCTTCAGC-3′，

Rab5b-R：5′-GGGGTACCCCATGATCAAGCAGCAGTCG-3′。

3.根据权利要求1所述的一种马铃薯StRab5b基因的克隆、载体构建和瞬时表达的方法，其特征在于：YEB液体培养基的成分为150μg/mL卡那霉素、100μg/mL利福平和20μM乙酰丁香酮，在温度28℃，转速200rpm的条件下振荡培养过夜。