[发明专利]一种马铃薯StRab5b基因的克隆、载体构建和瞬时表达的研究方法

说明书

本发明公开了一种马铃薯StRab5b基因的克隆、载体构建和瞬时表达的研究方法，解决的技术问题是马铃薯的晚疫病严重危害马铃薯的生产，研究小G蛋白的StRab5b基因的克隆、载体构建和瞬时表达，分析其在马铃薯抗晚疫病机制中的作用。本发明包括以下步骤：①查找马铃薯StRab5b的基因序列，设计克隆和构建载体所用的引物，对马铃薯的StRab5b基因进行克隆；对马铃薯的StRab5b基因克隆后，用载体pCAMBIA1300‑221，构建出表达载体PCAMBIA1300‑221‑StRab5b‑GFP；②采用步骤①构建出的表达载体注入烟草叶片中，观察表达载体在烟草叶片中的瞬时表达。本发明初步明确StRab5b基因在抗马铃薯晚疫病过程中的功能，为马铃薯抗病育种和新的种质资源的创制和挖掘奠定理论基础。

技术领域

本发明涉及基因表达领域，具体涉及一种马铃薯StRab5b基因的克隆、载体构建和瞬时表达的方法。

背景技术

马铃薯是世界上重要的粮食作物，晚疫病是由疫霉菌引起的，是一种世界广泛分布的病原菌，是严重危害马铃薯生产的重要病害，可导致马铃薯大幅度减产。1847年由于晚疫病传播引起的饥荒，使100多万爱尔兰人死亡。我国20世纪50-60年代初，华北、东北和西北曾几次发生晚疫病大流行，使马铃薯生产损失过半，因此，马铃薯晚疫病的防治已经成为当前世界马铃薯生产和育种中重要的防治病害之一。垂直抗性基因由于病原小种变异快而易失去抗性，水平抗性是在病菌小种侵染时，对其发展速度表现一定水平上的限制，因此开发和利用新的马铃薯抗晚疫病基因和转基因研究成为了马铃薯育种的关键问题(宋伯符，1997)，而植物的小G蛋白已成为调控多种信号通路及生理功能的分子开关，因此，研究小G蛋白的StRab5b基因的克隆、载体构建和表达，分析其在马铃薯抗晚疫病机制中的作用具有重要的意义。

植物中Rab蛋白功能多样，研究表明Rab蛋白中存在一些从酵母到哺乳动物非常保守的信号途径，随着基因组学和分子生物学的发展，为了进一步研究Rab蛋白的功能，Rab蛋白参与植物的抗病机制，特别是在马铃薯晚疫病方面的抗病机制的研究将得到进一步的解释。

发明内容

本发明要解决的技术问题是马铃薯的晚疫病严重危害马铃薯的生产，可导致马铃薯大幅度减产，研究小G蛋白的StRab5b基因的克隆、载体构建和瞬时表达，分析其在马铃薯抗晚疫病机制中的作用具有重要的意义，提供一种马铃薯StRab5b基因的克隆、载体构建和瞬时表达的研究方法。

为解决上述技术问题，本发明采用下述技术方案：一种马铃薯StRab5b基因的克隆、载体构建和瞬时表达的研究方法，包括以下步骤：采用感染晚疫病菌的烟草叶片，通过①查找马铃薯StRab5b的基因序列，设计克隆和构建载体所用的引物，对马铃薯的StRab5b基因进行克隆；对马铃薯的StRab5b基因克隆后，用载体pCAMBIA1300-221，构建出表达载体pCAMBIA1300-221-StRab5b-GFP；

②采用步骤①构建出的表达载体pCAMBIA1300-221-StRab5b-GFP注入烟草叶片中，观察表达载体pCAMBIA1300-221-StRab5b-GFP在烟草叶片中的瞬时表达，以评估上述表达载体抗烟草晚疫病的抗菌情况；

步骤①所述的对马铃薯的StRab5b基因进行克隆，构建出表达载体pCAMBIA1300-221-StRab5b-GFP的方法包括以下步骤：a、对马铃薯的StRab5b基因进行克隆后，利用高保真酶HS DNA Polymerase扩增马铃薯的StRab5b基因，回收扩增后马铃薯的StRab5b基因片段；将扩增后马铃薯的StRab5b基因片段与平末端载体(Simple Cloning Vector)连接后转入大肠杆菌DH5α并进行涂平板操作，涂平板后挑出大肠杆菌DH5α的阳性菌落并提取质粒，保存大肠杆菌DH5α菌液和质粒备用。