[发明专利]一种通过双位点切割实现猪Gjb2基因编码序列精准编辑的方法

权利要求书

1.通过双位点切割对猪Gjb2基因编码序列进行精准编辑的方法，其特征在于包括以下步骤：

a、准备一对sgRNA，其中一条sgRNA识别Gjb2基因编码序列上游的切割位点，另一条sgRNA识别基因编码序列下游的切割位点；

所述识别Gjb2基因编码序列下游切割位点的sgRNA能识别猪的Gjb2基因上的PAM位点为CGG；

所述识别Gjb2基因编码序列上游切割位点的sgRNA能识别猪的Gjb2基因上的PAM位点为GGG。

b、将步骤a所述的一对sgRNA、带有预期突变序列的供体DNA、编码spCas9的mRNA和/或spCas9纯化重组蛋白充分混合后，将混合物通过显微注射导入猪早期胚胎的细胞质中；

c、将步骤b处理后的猪早期胚胎移植至受体母猪的输卵管中，使受体母猪受孕；

d、受孕的受体母猪在妊娠期满后产下仔猪，得到Gjb2基因精准编辑后的猪模型。

2.根据权利要求1所述的通过双位点切割对猪Gjb2基因编码序列进行精准编辑的方法，其特征在于所述的sgRNA对中：

识别猪Gjb2基因编码序列下游切割位点的sgRNA的引导序列为5′-GAAUCUGUAUCUGGGAGACG-3′(SEQ ID NO.8)或其互补序列；

识别猪Gjb2基因编码序列上游切割位点的sgRNA的引导序列为5′-GACCAAGCGACACGGCACAG-3′(SEQ ID NO.9)或其互补序列。

3.根据权利要求1所述的通过双位点切割对猪Gjb2基因编码序列进行精准编辑的方法，其特征在于：所述的供体DNA为将猪Gjb2基因的37位缬氨酸(V)密码子突变为异亮氨酸(I)密码子的供体DNA。

4.根据权利要求1所述的通过双位点切割对猪Gjb2基因编码序列进行精准编辑的方法，其特征在于：所述的供体DNA的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示或为其互补序列。

5.根据权利要求1所述的通过双位点切割对猪Gjb2基因编码序列进行精准编辑的方法，其特征在于：所述的sgRNA对、供体DNA以及编码spCas9的mRNA和/或spCas9纯化重组蛋白之间的配比为按在混合物中的终浓度sgRNAs 10～15ng/uL、spCas9 mRNA和/或spCas9纯化重组蛋白20～25ng/uL、以及供体DNA 5～10ng/uL。

6.根据权利要求1的方法，其特征在于：所述的猪早期胚胎为4细胞期及之前的胚胎。

7.据权利要求9的方法，其特征在于所述的步骤c中还包括有检测验证步骤：使用引物对扩增仔猪基因组DNA样品，根据扩增结果测序确定是否含有预期基因编辑基因型Gjb2c.109-111GTG>ATC，若含有该基因型即表明建模成功。

8.制备Gjb2基因突变猪模型的试剂盒，其特征在于包括引导序列如下所示的sgRNA对：

5′-GAAUCUGUAUCUGGGAGACG-3′；

5′-GACCAAGCGACACGGCACAG-3′。

9.根据权利要求8所述的制备Gjb2基因突变猪模型的试剂盒，其特征在于还包括将猪Gjb2基因的37位缬氨酸(V)密码子突变为异亮氨酸(I)密码子的供体DNA，其核苷酸序列为SEQ ID No.1所示或为其互补序列。

10.根据权利要求8或9所述的制备Gjb2基因突变猪模型的试剂盒，其特征在于：还包括编码spCas9蛋白的mRNA和/或spCas9重组蛋白。