[发明专利]一种通过双位点切割实现猪Gjb2基因编码序列精准编辑的方法

说明书

本发明属于动物基因组编辑技术领域，具体涉及通过双位点切割实现猪Gjb2基因编码序列精准编辑的方法。本发明要解决的技术问题是提供一种Gjb2基因编码序列编辑精准编辑的猪模型制备方法。本发明解决上述技术问题的技术方案是提供通过双位点切割实现猪Gjb2基因编码序列精准编辑的方法。该方法包括以下步骤：a、准备sgRNA对；b、将sgRNA对、供体DNA、编码spCas9的mRNA和/或spCas9纯化重组蛋白的混合物导入猪早期胚胎细胞质中；c、将猪早期胚胎移至受体母猪输卵管中，使之受孕；d、妊娠期满后产下仔猪，得到Gjb2基因精准编辑后的猪模型。本发明方法可高效精准的实现猪Gjb2基因编码序列的精准突变，该类突变动物模型具有很好的应用前景。

技术领域

本发明属于动物基因组编辑技术领域，具体涉及一种通过双位点切割实现猪Gjb2基因编码序列精准编辑的方法和用于此法的试剂盒。

背景技术

Gjb2(Gap Junction Protein Beta 2)基因编码的Cx26蛋白属于缝隙连接蛋白基因家族，与相邻细胞的缝连接蛋白组成一个完整的缝隙连接通道，这些通道在信息传导和物质交换中起重要作用，是完成电解质、第二信使和代谢产物的细胞间转换的重要通道。Gjb2基因在物种之间高度保守，表达于内耳、食道、小肠、大脑皮质等部位，是重要的耳聋相关基因。Gjb2基因突变引起的耳聋大多表现为语前发病，且导致中重度或极重度耳聋，表现为先天性耳聋或迟发性听力损伤。Gjb2基因含有两个外显子，其中第一外显子为5’-UTR区，而蛋白编码序列则完全包含于第二外显子。

Gjb2基因由于其高度的保守性和重要的生物学功能，其双等位基因系统性敲出后动物往往具有致死表型。在遗传性耳聋病人中，Gjb2基因突变方式复杂多变，目前已有111种突变方式被报道，其中显性突变9种。Gjb2基因编码序列第235位碱基C缺失(Gjb2c.235delC)突变是中国人群最常见的遗传性耳聋突变，其人群突变携带率高达1.88-1.925％。Gjb2 c.235delC纯合突变导致常染色体隐性非综合征遗传性耳聋，患者多为双耳重深度耳聋(双耳大于90dB)，不仅纯合突变可以致聋，Gjb2c.235delC和其他致病突变位于两条不同的染色体上形成双重杂合性突变时，也可以导致耳聋。除Gjb2c.235delC突变以外，Gjb2基因编码蛋白第37位缬氨酸突变为异亮氨酸(GJB2 p.V37I)突变在中国人群中也有很高的发病率，并呈现与听力的高度相关性。但是，能精准模拟人类突变模式的“拟人化”Gjb2突变动物模型缺乏，导致其致病机制不清、靶向性治疗方案缺乏。因此，精准构建Gjb2基因突变动物模型，对深入研究Gjb2基因突变的致聋机制、研发更精准的基于机制的靶向治疗策略等具有重要的意义。

猪与人类在解剖学、生理学和生物化学方面具有相似性，并且猪模型被认为是生物医学研究与开发中具有广阔前景的转化模型。猪是创制耳聋动物模型的理想材料：猪与人在听觉器官的形态和结构方面具有极高相似性；猪对声音频率的敏感性及其阈值与人高度一致；猪耳蜗大小、形态、结构与人类非常相似；与人一样，在猪出生时，内耳形态已基本发育成熟，并具备正常听力，而小鼠等啮齿类动物为听觉系统晚熟动物：出生时无听力，出生后内耳需继续发育才具备正常听力；此外，由于耳蜗骨壁厚度、强度与人更为接近，猪耳蜗已经被广泛应用于耳蜗开窗术、耳蜗精细断层扫描术、电子耳蜗植入等外科技术的研发，是耳科学转化医学研究的重要模式动物。

尽管猪(尤其是体重与器官大小与人高度相似的小型猪)已用于多种人类重大疾病的基础与转化医学研究，例如心血管、代谢综合征、消化(胃)和骨骼疾病、糖尿病、心脏病、皮肤病和急性和慢性肠道炎症等，但是，目前尚无Gjb2基因突变猪及其它大动物模型的报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种Gjb2基因编码序列精准编辑的猪模型制备方法。本发明解决上述技术问题的技术方案是提供了一种通过双位点切割实现猪Gjb2基因编码序列精准编辑的方法。

该方法包括以下步骤：