[发明专利]制备心脏祖细胞的方法

权利要求书

1.一种制备心脏祖细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

诱导重编程因子在起始重编程对象细胞内转录激活，

所述重编程因子包括GATA4、HAND2、MEF2C、TBX5和MEIS1。

2.根据权利要求1所述的制备心脏祖细胞的方法，其特征在于，所述诱导重编程因子在起始重编程对象细胞内转录激活，包括以下步骤：

针对每一种重编程因子，分别构建靶向sgRNA-MS2融合表达载体；

将所述靶向sgRNA-MS2融合表达载体转导至稳定表达dCas9-VP64融合蛋白和MS2-p65-HSF1融合蛋白的起始重编程对象细胞内。

3.根据权利要求2所述的制备心脏祖细胞的方法，其特征在于，所述起始重编程对象细胞的制备方法包括以下步骤：

将能够表达所述dCas9-VP64融合蛋白的慢病毒和能够表达所述MS2-p65-HSF1融合蛋白的慢病毒同时感染细胞。

4.根据权利要求1-3任一项所述的制备心脏祖细胞的方法，其特征在于，所述起始重编程对象细胞为人包皮成纤维细胞。

5.根据权利要求1-3任一项所述的制备心脏祖细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

取生长良好且稳定表达dCas9-VP64融合蛋白和MS2-p65-HSF1融合蛋白的起始重编程对象细胞，以3000-5000个细胞/cm²接种于培养皿；

加入靶向sgRNA-MS2融合表达载体的慢病毒颗粒，培养20-28h后，弃去含有慢病毒颗粒的培养液，用诱导培养液培养，每隔20-28h更换一次诱导培养液。

6.根据权利要求5所述的制备心脏祖细胞的方法，其特征在于，用诱导培养液培养的时间为3-10天。

7.根据权利要求5所述的制备心脏祖细胞的方法，其特征在于，所述诱导培养液由以下组分组成：

8％-12％新生乳鼠心肌细胞培养液、8％-12％胎牛血清、4％-6％马血清、0.5％-1.5％青霉素与链霉素的混合物、0.5％-1.5％B-27、0.5％-1.5％必需氨基酸、0.5％-1.5％胰岛素-转铁蛋白-硒、0.5％-1.5％非必需氨基酸、0.5％-1.5％维生素混合液、0.5％-1.5％丙酮酸钠和700-1300单位/mL LIF；

余量为DMEM培养基与Medium 199培养基以3-5:1的体积比混合的混合培养基。

8.根据权利要求7所述的制备心脏祖细胞的方法，其特征在于，所述LIF浓度为800-1200单位/mL。

9.根据权利要求7或者8所述的制备心脏祖细胞的方法，其特征在于，所述必需氨基酸包括以下组分：L-精氨酸、L-半胱氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸。

10.根据权利要求7或者8所述的制备心脏祖细胞的方法，其特征在于，所述非必需氨基酸包括以下组分：甘氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸。

11.根据权利要求7或者8所述的制备心脏祖细胞的方法，其特征在于，所述维生素混合液包括：氯化胆碱、D-泛酸钙、维生素B、烟酰胺、盐酸吡哆醛、维生素B2、维生素B1、肌醇。