[发明专利]制备心脏祖细胞的方法

说明书

本发明提供了一种基于内源基因转录激活的心脏祖细胞直接重编程方法。所述方法具有较好的操作可行性和理论创新性，首次通过CRISPR/Cas9系统激活内源心脏发育相关转录因子GATA4、HAND2、MEF2C、TBX5和MEIS1，诱导人包皮成纤维细胞重编程为具有向心肌细胞、平滑肌细胞和内皮细胞分化潜能的心脏祖细胞，为心血管疾病模型构建、新药筛选与心肌再生提供种子细胞来源，同时丰富了新型表观细胞重编程理论和内涵。

技术领域

本发明属于细胞生物学领域，特别涉及一种制备心脏祖细胞的方法。

背景技术

心肌细胞属于终末分化的细胞，再生能力有限。心脏急性心肌梗死后，内源性心肌细胞再生能力有限，不能有效阻止心脏疾病的进展。以干细胞为基础的再生医学为心肌再生开辟了一条新的途径。研究者开始利用细胞重编程技术诱导成纤维细胞转变为心脏祖细胞，为心肌再生提供丰富的种子细胞来源。

2010年，Ieda等首次报道，通过病毒携带心脏发育相关的三个转录因子GATA4、MEF2C和TBX5将小鼠心肌成纤维细胞直接重编程为心肌样细胞。Song等在GATA4、MEF2C和TBX5基础上添加HAND2，有效地诱导小鼠鼠尾成纤维细胞重编程为具有电生理特性且能够自发跳动的心肌样细胞。Nam等选取GATA4、HAND2、TBX5、MYOCD和miR-1、miR-133，在体外诱导人皮肤成纤维细胞直接重编程为心肌样细胞。Lalit等通过慢病毒携带转录因子MESP1、TBX5、GATA4、NKX2-5和染色质重塑因子BAF60C诱导小鼠心肌成纤维细胞和鼠尾成纤维细胞重编程为心脏祖细胞。上述例子是通过外源转基因过表达心脏发育相关转录因子诱导成纤维细胞重编程为心肌样细胞和心脏祖细胞。该技术需要将外源基因连接在相关病毒载体上进行过表达。然而，大片段基因序列难以进行分子克隆实验操作和病毒包装，且不能直接进入内源基因位点使染色质迅速重构。因此，通过外源转基因诱导细胞重编程制备心脏祖细胞的效率较低。

发明内容

基于此，本发明的目的在于提供一种基于内源基因转录激活、细胞重编程效率高的心脏祖细胞制备方法。

具体技术方案如下：

一种制备心脏祖细胞的方法，包括以下步骤：

诱导重编程因子在起始重编程对象细胞内转录激活，所述重编程因子包括GATA4、HAND2、MEF2C、TBX5或MEIS1中的至少四种；

在其中一些实施例中，所述重编程因子包括GATA4、HAND2、MEF2C和TBX5。

在其中一些实施例中，所述重编程因子包括GATA4、HAND2、MEF2C、TBX5和MEIS1。

在其中一些实施例中，所述诱导重编程因子在起始重编程对象细胞内转录激活，包括以下步骤：

针对每一种重编程因子，分别构建靶向sgRNA-MS2融合表达载体；

将所述靶向sgRNA-MS2融合表达载体转导至稳定表达dCas9-VP64融合蛋白和MS2-p65-HSF1融合蛋白的起始重编程对象细胞内。

在其中一些实施例中，所述靶向sgRNA-MS2融合表达载体包括以下至少四种：

GATA4基因的靶向sgRNA-MS2融合表达载体、HAND2基因的靶向sgRNA-MS2融合表达载体、MEF2C基因的靶向sgRNA-MS2融合表达载体、TBX5基因的靶向sgRNA-MS2融合表达载体、MEIS1基因的靶向sgRNA-MS2融合表达载体。

在其中一些实施例中，所述起始重编程对象细胞的制备方法包括以下步骤：

将能够表达所述dCas9-VP64融合蛋白的慢病毒和能够表达所述MS2-p65-HSF1融合蛋白的慢病毒同时感染细胞。