[发明专利]一种甲基化保护宿主菌及其构建方法和应用

说明书

本发明提供了一种甲基化保护宿主菌及其构建方法和应用，所述甲基转移酶的氨基酸序列包括如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，核苷酸序列包括如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，所述宿主菌转化有甲基转移酶表达载体，实现了对宿主菌基因组DNA的甲基化保护作用，避免了NdeI对宿主DNA的切割作用，可以用于表达包括NdeI在内的多种限制性内切酶。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种宿主菌及其构建方法和应用，尤其涉及一种表达限制性内切酶NdeI的甲基化保护宿主菌及其构建方法和应用。

背景技术

在生物体内有一类酶能够切断外来DNA，限制异源DNA的侵入并使之失去活力，但对自身DNA无损害作用，从而起到保护细胞原有遗传信息的作用。由于这种切割作用是在DNA分子内部进行的，故名限制性内切酶(简称限制酶)。限制性内切酶的发现促进了DNA重组技术的诞生，极大地推动了现代分子生物学和基因工程的发展，是当代基因工程研究不可或缺的基础工具。

细菌体内存在“限制-修饰”现象，内源DNA通过被甲基化酶修饰，避免了限制性内切酶的切割作用，达到了抵御外来噬菌体侵染的目的。在原核表达体系中单一地重组表达限制性内切酶，会导致宿主DNA被切割而死亡。甲基转移酶通过在限制性内切酶的识别序列上进行甲基化修饰，可有效防止限制性内切酶的切割作用。限制-修饰基因紧密连锁，细菌通过调控两者的表达，首先使自身DNA受到甲基化保护，随后再表达限制性内切酶，而入侵的异源DNA由于没有受到保护而被降解(Geoffery G.W.，Nucleic Acids Reseach，2539-2564，1991)。

研究表明，限制-修饰系统在原核细胞中的建立和维持是以甲基转移酶的保护作用为前提的。甲基化修饰是蛋白质修饰的重要形式之一，参与了原核生物和真核生物的多项细胞进程。基于DNA分子的结构与性质，自然界中主要存在三类DNA甲基转移酶，分别是C⁵胞嘧啶甲基酶、N⁴胞嘧啶甲基酶和N⁶腺嘌呤甲基酶。其中，N⁴胞嘧啶甲基酶和N⁶腺嘌呤甲基酶属于氨基-甲基转移酶(Malone et al.，J.Mol.Biol.，618-632，1995)。DNA在甲基转移酶的作用下，催化底物S-腺苷甲硫氨酸转移一个甲基至胞嘧啶的C⁵位置，生成5-甲基胞嘧啶。当DNA被甲基转移酶修饰后，便具有了抵抗限制性内切酶的特性。即通常情况下，如果限制酶的识别序列相同或包含在内，并且甲基化酶修饰位点和方式一致，那么经过修饰的DNA就能够抵抗限制性内切酶的切割作用，从而保护宿主细胞DNA免受破坏。例如AluI的识别序列为5’-AGCT-3’，包含在SacI的识别序列5’-GAGCTC-3’之中，两者的甲基化位点和修饰方式一致(C⁵胞嘧啶甲基酶)，因此可以通过在宿主菌内表达M.AluI来抵抗限制酶SacI对DNA的酶切。

NdeI是一种应用较为广泛的限制性内切酶，可以识别六个碱基的核酸序列(5’-CA^TATG-3’)，不仅可以作为普通的限制性内切酶应用于分子克隆，在生物领域的其他方向也具有重要的应用价值及研究潜力。但是，NdeI限制性内切酶存在表达量低、分离纯化程序繁琐、蛋白得率低等问题，目前市售的NdeI限制酶价格昂贵，限制了其应用与研究。