[发明专利]基于双匙解锁机制检测miRNA的试剂盒及应用

权利要求书

1.一种基于“双匙解锁机制”检测miRNA的试剂盒，其特征在于，包括荧光编码“锁状”探针、信号富集探针以及双链特异性核酸酶；所述的荧光编码“锁状”探针为氨基化茎环DNA与羧基化荧光编码纳米球偶联得到；所述的信号富集探针为氨基化单链DNA与羧基化聚苯乙烯微球偶联得到。

2.根据权利要求1所述的基于“双匙解锁机制”检测miRNA的试剂盒，其特征在于，所述的偶联剂为EDC。

3.根据权利要求1所述的基于“双匙解锁机制”检测miRNA的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒采用下述方法使用：

1)“双钥解锁”及靶标循环回收：miRNA与所述的荧光编码“锁状”探针中的茎环DNA互补配对，然后加入双链特异性核酸酶特异性切割杂交链中的DNA，在miRNA/DSN“双钥”作用下，解锁荧光编码“锁状”探针，并引发靶标循环反应，实现信号放大；

2)信号富集扩增及流式微球定量：解锁的荧光编码探针中的DNA单链与所述的信号富集探针中DNA单链互补配对，将荧光信号富集于比表面积较大的聚苯乙烯微球表面，实现信号富集扩增；无需多次清洗纯化步骤，直接将富集荧光信号的聚苯乙烯微球进行流式分析，实现定量检测。

4.根据权利要求1所述的基于“双匙解锁机制”检测miRNA的试剂盒，其特征在于，所述的荧光编码“锁状”探针的制备具体的包括下述步骤：将羧基化荧光纳米球、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐水溶液按照摩尔比为1：1-4比例混合于磷酸缓冲液中，涡旋仪上低速旋转使其混匀，然后将上述混合溶液置于旋转混合架上，室温下反应15-30分钟，然后加入氨基化茎环DNA，室温下反应过夜；反应结束后，采用离心分离进行纯化，用PBS缓冲液至少清洗三次以除去未反应的茎环DNA，得到荧光编码“锁状”探针。

5.根据权利要求1所述的基于“双匙解锁机制”检测miRNA的试剂盒，其特征在于，所述的信号富集探针采用下述方法制备：(1)将羧基化聚苯乙烯微球、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐水溶液按照摩尔比为1：1-4比例混合于磷酸缓冲液中，涡旋仪上低速旋转使其混匀，然后将上述混合溶液置于旋转混合架上，室温下反应15-30分钟，然后加入氨基化单链DNA，室温下反应过夜；反应结束后，采用离心分离进行纯化，用PBS缓冲液至少清洗三次以除去未反应的单链DNA，得到信号富集探针。

6.根据权利要求3所述的基于“双匙解锁机制”检测miRNA的试剂盒，其特征在于，“双钥解锁”及靶标循环回收的具体步骤为：将荧光编码“锁状”探针、待检miRNA按照体积比为1-3:1比例混合于磷酸缓冲液中，加入0.1-0.6U双链特异性核酸酶及10×双链特异性核酸酶缓冲液，涡旋仪上低速旋转使其混匀，然后将上述混合溶液置于金属浴中，35-60℃下反应20-120分钟，实现靶标循环回收及信号放大。反应结束后，加入终止液，45℃反应5分钟，使酶失活。

7.根据权利要求3所述的基于“双匙解锁机制”检测miRNA的试剂盒，其特征在于，富集扩增及流式微球定量的具体步骤为：加入信号富集探针加入5-30微升，使DNA进行互补配对，实现荧光信号富集，并用流式进行微球荧光定量分析。

8.根据权利要求1-7任一项所述的基于“双匙解锁机制”检测miRNA的试剂盒的应用，其特征在于，用于检测miRNA-21、miRNA-141或者混合同检。