[发明专利]基于双匙解锁机制检测miRNA的试剂盒及应用

说明书

本发明属于检测用试剂盒领域，具体涉及一种基于“双匙解锁机制”检测miRNA的试剂盒及应用。试剂盒包括荧光编码“锁状”探针、信号富集探针以及双链特异性核酸酶；所述的荧光编码“锁状”探针为氨基化茎环DNA与羧基化荧光编码纳米球偶联得到；所述的信号富集探针为氨基化单链DNA与羧基化聚苯乙烯微球偶联得到。本发明基于DSN‑miRNA双重解锁机制及信号富集扩增策略，结合流式荧光微球编码技术，实现了miRNA‑21及miRNA‑41的分检以及同检研究。

技术领域

本发明属于检测用试剂盒领域，具体涉及一种基于“双匙解锁机制”检测 miRNA的试剂盒及应用。

背景技术

微小RNA(miRNA)是一种具有短长度(约22个核苷酸)的内源性非编码小分子，并与信使RNA结合以参与转录后水平的基因表达调控。大量的研究表明，多种miRNA的异常表达与各种疾病，特别是人类肿瘤和癌症密切相关。例如， miRNA-21和miRNA-141是常见人类癌症中过表达的上皮相关miRNA，包括乳腺癌，肺癌和前列腺癌等。实现miRNA的高通量同检有助于提高检测的准确性。目标miRRNA-21和miRNA-141作为重要肿瘤标志物可用于肿瘤的的诊断，治疗和预后，具有重要的临床意义。然而，由于其低浓度，小尺寸和高同源性等特征，实现其简单、准确、特异及灵敏的检测仍是一项巨大的挑战。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种基于“双匙解锁机制”检测miRNA的试剂盒及应用。

本发明为实现上述目的，采用以下技术方案：

一种基于“双匙解锁机制”检测miRNA的试剂盒，包括荧光编码“锁状”探针、信号富集探针以及双链特异性核酸酶；所述的荧光编码“锁状”探针为氨基化茎环DNA(DNA-21:CCTCAACATCAGTCTGATAAGCTAGTTGAGG TTTTTTTTT TT-NH₂，DNA-141：ATTGTGACAGACCATTTCTACCACAATT TTTTTTTTTTT-NH₂)与羧基化荧光编码纳米微球(北京华泰昕，红色：cat.no.QDSCF20050，绿色：cat.no. QDSCF10050)偶联得到；所述的信号富集探针为氨基化单链DNA(生工，ssDNA-21： AAAACCTCAACC-NH2，ssDNA-141：AAAAATTGTTTT-NH2)与羧基化聚苯乙烯微球(天津倍思乐色谱技术开发中心，cat.no.6–3-1000)偶联得到。偶联剂为EDC。

所述的试剂盒采用下述方法使用：

1)“双钥解锁”及靶标循环回收：miRNA与所述的荧光编码“锁状”探针中的茎环DNA互补配对，然后加入双链特异性核酸酶特异性切割杂交链中的DNA，在miRNA/DSN“双钥”作用下，解锁荧光编码“锁状”探针，并引发靶标循环反应，实现信号放大；

2)信号富集扩增及流式微球定量：解锁的荧光编码探针中的DNA单链与所述的信号富集探针中DNA单链互补配对，将荧光信号富集于比表面积较大的聚苯乙烯微球表面，实现信号富集扩增；无需多次清洗纯化步骤，直接将富集荧光信号的聚苯乙烯微球进行流式分析，实现定量检测。

优选的，所述的荧光编码“锁状”探针的制备具体的包括下述步骤：将羧基化荧光纳米球、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐水溶液按照摩尔比为1：1-4比例混合于磷酸缓冲液中，涡旋仪上低速旋转使其混匀，然后将上述混合溶液置于旋转混合架上，室温下反应15-30分钟，然后加入氨基化茎环DNA，室温下反应过夜；反应结束后，采用离心分离进行纯化，用PBS缓冲液至少清洗三次以除去未反应的茎环DNA，得到荧光编码“锁状”探针。