[发明专利]一种同时富集糖肽和磷酸化肽的方法

权利要求书

1.一种同时富集、在线酶切分离糖肽和磷酸化肽的方法，其特征在于，该方法是将聚合物富集材料与糖蛋白酶解物、磷酸化蛋白酶解物接触，采用柱固相萃取模式或分散固相萃取模式同时富集糖肽和磷酸化肽，并在线对糖肽进行酶切，实现糖肽和磷酸化肽的分步洗脱并进行质谱分析；所述糖肽和磷酸化肽同时聚合物富集材料是组氨酸类功能单体接枝到聚合物主链上，并通过聚合物主链进一步连接到基质材料上或者组氨酸类功能单体聚合到基质材料上，得到聚合物富集材料；

其中，组氨酸类功能单体为组氨酸及组氨酸衍生物中的任意一种或二种以上。

2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述聚合物富集材料结构示意为：

其中M为基底材料，其中R包括但不限于羟基、氨基、甲氧基、乙氧基中的一种或二种以上；所述聚合度n的范围为2-200。

3.按照权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述聚合物富集材料是利用表面引发-原子转移自由基聚合，将带有组氨酸类功能单体的聚合物经单体在基底材料表面经过聚合所得。

4.按照权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于：所述基底材料包括但不限于下述材料中的任意一种或者两种以上任意比例的混合

多孔材料中的多孔SiO₂、多孔Al₂O₃、多孔TiO₂或多孔ZrO₂；以及表面涂覆有多孔材料(多孔SiO₂、多孔Al₂O₃、多孔TiO₂或多孔ZrO₂中的一种或者两种以上)的Si、Au或Fe₃O₄；其中多孔基底材料的粒径是0.2-50μm；多孔材料的孔径为涂覆层的厚度1-20nm。

5.按照权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述聚合物主链包括但不限于聚乙烯、聚乙二胺、聚乙二醇、聚丙烯酸或聚丙烯酰胺中的任意一种或二种以上。

6.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述聚合物富集材料组氨酸类功能单体与基底物质的质量比范围为1:0.1-200，其中优先选择组氨酸类功能单体与基底物质的质量比范围为1:1-100。

7.按照权利要求1-6任一所述的方法，其特征在于：同时富集、在线酶切分离具体操作采用固相萃取模式(SPE)或分散固相萃取模式(dSPE)同时富集糖肽和磷酸化肽；

在SPE模式下同时富集糖肽和磷酸化肽时，将样品上到填装有聚合物富集材料的SPE柱上，采用淋洗流动相冲洗材料，去除其上的非糖肽和非磷酸化肽；再将结合有糖肽和磷酸化肽的材料加入PNGase F酶，切掉糖肽上的糖链，释放出切掉糖链的糖肽；再采用不同洗脱流动相洗脱，分步洗脱去糖链的糖肽段和磷酸化肽；或在dSPE模式下富集纯化糖肽和磷酸化肽时，将样品直接与基于组氨酸的聚合物材料混合，离心，弃去上清液；采用淋洗流动相冲洗材料，离心，去除其上的非糖肽和非磷酸化肽；再将结合有糖肽和磷酸化肽的材料加入PNGase F酶切掉连有糖链的肽段；再采用不同洗脱流动相冲洗，离心，分步收集去糖肽段和磷酸化肽。

8.按照权利要求7所述方法，其特征在于：1)样品的上样量与材料的质量比例为1:5-200；2)富集和分离温度为10-60℃；3)淋洗流动相和洗脱流动相的体积为3-1000倍的材料体积；4)PNGase F用量与样品的上样量质量比例为：1:10-50；5)PNGase F酶切温度为10-60℃；6)PNGase F酶切反应溶剂的体积为3-1000倍的材料体积；7)PNGase F酶切反应时间为1-24h。

9.按照权利要求7或8所述方法，其特征在于：

1)淋洗流动相的流动相组成如下a-f任一之一所示：

a.A相为水，B相为乙腈，体积比A/B:10/90-40/60；

b.A相为水，B相为甲醇，体积比A/B:10/90-40/60；

c.A相为甲酸铵水溶液(pH 3-6)，B相为乙腈，体积比A/B:5/95-40/60；

d.A相为甲酸铵水溶液(pH 3-6)，B相为甲醇，体积比A/B:5/95-40/60；

e.A相为甲酸水溶液(pH 2-4)，B相为乙腈，体积比A/B:5/95-40/60；

f.A相乙酸水溶液(pH 2-4)，B相为甲醇，体积比A/B:5/95-40/60；

2)洗脱流动相的溶剂组成如下a-f任一之一所示：

a.A相为水，B相为乙腈，体积比A/B:40/60-100/0；

b.A相为水，B相为甲醇，体积比A/B:40/60-100/0；

c.A相为氨水水溶液(pH 8-11)，B相为乙腈，体积比A/B:40/60-100/0；

d.A相为碳酸氢铵水溶液(pH 7-9)，B相为甲醇，体积比A/B:40/60-100/0；

e.A相为乙酸铵水溶液(pH 5-7)，B相为乙腈，体积比A/B:40/60-100/0；

f.A相为磷酸氢钾水溶液(pH 8-10)，B相为甲醇，体积比A/B:40/60-100/0；

其中缓冲盐溶液浓度1-200mM；

3)PNGase F酶切反应的溶剂组成如下a-c任一之一所示：

a.A相为磷酸氢钾水溶液(pH 7-9)，B相为甲醇，体积比A/B:40/60-100/0；

b.A相为碳酸氢铵水溶液(pH 7-9)，B相为甲醇，体积比A/B:40/60-100/0；

c.A相为Tris(三羟甲基氨基甲烷)水溶液(pH 7-9)，B相为甲醇，体积比A/B:40/60-100/0；其中缓冲盐溶液浓度1-200mM。