[发明专利]一种同时富集糖肽和磷酸化肽的方法

说明书

本发明合成了一种糖肽和磷酸化肽同时富集、在线酶切、分步洗脱的分析方法。该方法是将聚合物富集材料与糖蛋白和磷酸化蛋白的酶解物接触，采用柱固相萃取模式或分散固相萃取模式同时富集糖肽和磷酸化肽，并对富集在聚合物富集材料上的糖肽进行酶切，切除糖链，从而释放出切掉糖链的糖肽，实现糖肽和磷酸化肽的分步洗脱。所述聚合物富集材料是利用表面引发‑原子转移自由基聚合反应机制，将组氨酸衍生物功能单体在基底表面经过聚合所得。该方法通过对富集过程pH、酶解反应时间等条件的控制，实现了复杂混合物中糖肽和磷酸化肽高选择性、高重复性和高通量的同时富集，显著提高了一次样品分析中糖蛋白的鉴定数目和磷酸化蛋白鉴定数目。

技术领域

本发明涉及材料分析化学和翻译后修饰蛋白组学等领域，尤其涉及一种同时富集分离糖肽和磷酸化肽的方法。

背景技术

蛋白质糖基化和磷酸化是生物体内最常见、最重要的两种蛋白翻译后修饰方式，其在细胞生命活动中具有重要的调控作用，因此在分子水平研究蛋白质糖基化和磷酸化，及二者之间的相互作用对揭示其在生命过程的调节机制意义重大。以质谱为基础的蛋白组学方法是鉴定蛋白糖基化和磷酸化的常规方法。但是在质谱分析前，需要对低丰度的糖肽、磷酸化肽进行选择性的富集，以提高糖肽、磷酸化肽在质谱中信号强度和鉴定数目。已有的糖肽富集方法主要有凝集素法、肼化学法、硼酸法以及亲水作用色谱法等，其中亲水作用色谱法应用最为广泛。固定金属离子亲和色谱法和金属氧化物法常用于磷酸化肽/磷酸化蛋白的富集。目前同时富集糖肽和磷酸化肽的方法普遍基于固定金属离子亲和色谱法或金属氧化物法和亲水作用色谱法。但是这样的方法都存在一定的局限性：单一材料难以实现糖肽和磷酸化肽的分步洗脱；共富集后鉴定糖基化位点，中间过程多，造成部分糖基化和磷酸化信息丢失；多磷酸化肽死吸附等问题。因此，为了实现复杂生物样品中共同富集、分步洗脱糖肽和磷酸化肽的目的，亟需一种简单高效，在保证糖肽和磷酸化肽覆盖率的同时又能有效排除非糖肽和非磷酸化肽干扰的新型共同富集方法。

发明内容

本发明为解决上述技术问题提供一种具有高选择性、高吸附量、操作简单和重复性好的共同富集分离糖肽和磷酸化肽的方法，能对低化学计量的糖肽和磷酸化肽进行选择性富集和分离。

本发明的技术方案如下：

一种同时富集、在线酶切分离糖肽和磷酸化肽的方法，其特征在于，该方法是将聚合物富集材料与糖蛋白酶解物、磷酸化蛋白酶解物接触，采用柱固相萃取模式或分散固相萃取模式同时富集糖肽和磷酸化肽，并在线对糖肽进行酶切，实现糖肽和磷酸化肽的分步洗脱并进行质谱分析。所述聚合物富集材料结构为：

所述聚合物富集材料是利用表面引发-原子转移自由基聚合反应机制，将组氨酸类功能单体在基底材料表面经过聚合所得。

上述方案中，具体操作采用固相萃取模式(SPE)或分散固相萃取模式(dSPE)同时富集糖肽和磷酸化肽，具体步骤如下：

在SPE模式下同时富集糖肽和磷酸化肽时，将样品上到填装有基于组氨酸的聚合物材料的SPE柱上，采用淋洗流动相冲洗材料，去除其上的非糖肽和非磷酸化肽；再将结合有糖肽和磷酸化肽的材料加入PNGase F酶切掉连有糖链的肽段；再采用不同洗脱流动相冲洗，分步洗脱去糖肽段和磷酸化肽；或在dSPE模式下富集纯化糖肽和磷酸化肽时，将样品直接与基于组氨酸的聚合物材料混合，离心，弃去上清液；采用淋洗流动相冲洗材料，离心，去除其上的非糖肽和非磷酸化肽；再将结合有糖肽和磷酸化肽的材料加入PNGase F酶切掉连有糖链的肽段；再采用不同洗脱流动相冲洗，离心，分步收集去糖肽段和磷酸化肽；

本发明具有如下有益效果：

1.本发明的糖肽和磷酸化肽共富集方法在分离富集糖肽时表现出了高选择性和高效率等特点，可以实现糖肽和磷酸化肽的共富集和分步洗脱；