[发明专利]一种叶酸代谢相关基因多态性的检测方法

权利要求书

1.一种叶酸代谢相关基因多态性的检测方法，其特征在于，包括：

提取受试者的基因组DNA；

配置包含SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.3所示的单碱基延伸引物序列的单碱基延伸反应体系，并配置包含SEQ ID NO.4～SEQ ID NO.9所示的特异性扩增引物序列和所述基因组DNA的聚合酶链式反应PCR扩增体系；

顺次对所述PCR扩增体系进行扩增反应；

顺次对扩增反应后的体系进行消化处理；

顺次混合消化处理后的体系和所述单碱基延伸反应体系，获得混合液，并对所述混合液进行延伸反应；

顺次对延伸反应后的体系进行纯化处理；

利用液相色谱-质谱联用仪检测纯化处理后的产物，确定所述基因组DNA特定SNP位点的基因型；

其中，所述液相色谱-质谱联用仪的洗脱流动相为含0.5％～5％(v/v)六氟异丙醇和0.03％～0.5％(v/v)三乙胺的蒸馏水，以及含0.5％～5％(v/v)六氟异丙醇和0.03％～0.5％(v/v)三乙胺的甲醇，洗脱方式为梯度洗脱，所述液相色谱-质谱联用仪中的质谱仪为TripleTOF系列质谱仪。

2.根据权利要求1所述的叶酸代谢相关基因多态性的检测方法，其特征在于，

所述高效液相色谱仪的色谱条件包括：

C18反相色谱柱，所述C18反相色谱柱的柱温为：40～70℃，进样量为：10～50μl。

3.根据权利要求1所述的叶酸代谢相关基因多态性的检测方法，其特征在于，

所述TripleTOF系列质谱仪的质谱条件，包括：

采用电喷雾离子源ESI，极性为Negative，TOF MS扫描模式，喷雾电压为-4000～-5000V，温度为450～600℃，气帘气为10～30Psi，雾化气为40～60Psi，辅助气为40～60Psi，去簇电压为-40～-80V，入口电压为-5～-25V，真空度为2～6e^-5Torr。

4.根据权利要求1所述的叶酸代谢相关基因多态性的检测方法，其特征在于，

所述SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.3所示的单碱基延伸引物序列，包括：

SEQ ID NO.1所示为MTHFR基因的C677T位点的单碱基延伸引物序列：5’-AGAGGTGTCTGCGGGAG-3’；

SEQ ID NO.2所示为MTHFR基因的A1298C位点的单碱基延伸引物序列：5’-AGGGAGCTGACCAGTGAAG-3’；

SEQ ID NO.3所示为MTRR基因的A66G位点的单碱基延伸引物序列：5’-CGCATCGCAGAAGAAAT-3’；

和/或，

所述SEQ ID NO.4～SEQ ID NO.9所示的特异性扩增引物序列，包括：

SEQ ID NO.4所示为MTHFR基因C677T位点的特异性扩增引物序列中的正向引物序列：5’-ACGTTGGATGGTCACCTGGATGGGAAAGATCC-3’；

SEQ ID NO.5所示为MTHFR基因C677T位点的特异性扩增引物序列中的反向引物序列：5’-ACGTTGGATGGTCTTCATCCCTCGCCTTGAAC-3’；

SEQ ID NO.6所示为MTHFR基因A1298C位点的特异性扩增引物序列中的正向引物序列：5’-ACGTTGGATGGAGACCTTCCTTGCAAATACATC-3’；

SEQ ID NO.7所示为MTHFR基因A1298C位点的特异性扩增引物序列的反向引物序列为：5’-ACGTTGGATGGATCACTCACTTTGTGACCATTC-3’；

SEQ ID NO.8所示为MTRR基因A66G位点的特异性扩增引物序列的正向引物序列：5’-ACGTTGGATGCGCTCTAACCTTATCGGATTCACTAAT-3’；

SEQ ID NO.9所示为MTRR基因A66G位点的特异性扩增引物序列的反向引物序列：5’-ACGTTGGATGCAAGTGATGAGGAGGTTTCTGTTACTA-3’。