[发明专利]一种水蛭素编码基因及包含该基因的宿主系统

说明书

本发明公开了一种水蛭素编码基因及包含该基因的宿主系统。本发明首次从日本医蛭唾液腺组织中利用多种PCR方法得到该编码基因，突破了以往根据已知蛋白或多肽的氨基酸序列推测基因的核苷酸序列，然后进行人工合成的传统方法。采用本发明中的方法得到编码基因后将其重组到表达载体中，并将表达载体转化至宿主细胞中，利用宿主细胞可以高效的生产水蛭素，可有效解决药典水蛭品种因生物量小、资源限制等问题无法满足人民群众用药需求的问题。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种水蛭素编码基因及包含该基因的宿主系统。

背景技术

水蛭素是目前已知的自然界中最强的天然抗凝血因子，在治疗心脑血管疾病方面具有靶标性强、起效快、无毒副作用等独特优势。由于天然水蛭素原料有限，产量低，成本高，限制了其临床应用。日本医蛭(Hirudo nipponia)是中国药典收载的唯一含有水蛭素的水蛭药材品种，具有极强的抗凝血酶活性和抗血小板聚集作用，临床治疗心脑血管疾病效果极佳，药材及产品供不应求，加之资源匮乏，难以解决人民的用药需求。

目前获取水蛭素基因序列均采用全人工合成方法，即根据已知的蛋白或多肽的氨基酸序列推测出相应结构基因的核苷酸序列，然后进行人工合成。该方法虽然操作简单，但由于天然水蛭素存在多种变异体，很难获取目标基因序列。

毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统是近几年在外源蛋白表达方面应用比较广泛的一套工具，并被广泛应用于疫苗抗原、细胞因子、蛋白酶、蛋白类激素和抗体等生物活性蛋白的表达。相较于其他表达载体毕赤酵母表达系统在蛋白制剂的研究和开发中有不可比拟的优势。在医学及临床上具有广阔的应用前景。

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供一种水蛭素编码基因以及获得该编码基因的方法，并基于该编码基因获得一种新的重组质粒和宿主系统，以解决药典水蛭品种因生物量小、资源限制等问题无法满足人民群众用药需求的问题。

为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：提供一种水蛭素编码基因，编码基因的编码序列如SEQ ID NO.4所示。

水蛭素编码基因的获取包括以下步骤：

S1：取日本医蛭，挑取其唾液腺组织，放入RNAwait中备用；

S2：提取唾液腺组织中的RNA；

S3：根据提取的RNA进行cDNA第一链的合成，并据此进行扩增得核心序列，核心序列如SEQ ID NO.1所示；

S4：对cDNA进行5’末端和3’末端快速扩增，并分别测序，测序结果分别如SEQ IDNO.2和SEQ ID NO.3所示；

S5：根据核心序列以及S4中得到序列拼接出水蛭素编码基因。

S3中cDNA第一链的合成包括如下步骤：

(1)将RNA与浓度为100uM的oligo引物按1:1μg/μL的料液比混合；

(2)将上述混合物于65℃下放置5min，再冰上冷却1min；然后向混合物中加入5Xreaction buffer、RiboLock RNase Inhibitor、dNTP mix和RevertAid M-MuLV ReverseTranscriptase，随后离心；

(3)将离心后的混合液置于PCR仪上，42℃孵育1h；然后在70℃下赋予5min，完成cDNA第一链的合成。

S3中PCR扩增体系为：

其中，primer F和primer R分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。