[发明专利]一株八角内生真菌及其转化反式茴脑生成异香兰酸的方法

权利要求书

1.一株八角内生真菌，其特征在于：该菌株为假可可毛色二孢菌（Lasiodiplodia pseudotheobromae）BJEF32，其可转化反式茴脑生成异香兰酸，已于2019年06月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.18138。

2.如权利要求1所述的八角内生真菌，其特征在于：所述假可可毛色二孢菌（Lasiodiplodia pseudotheobromae）BJEF32的rDNA-ITS序列如SEQ ID NO: 1所示。

3.如权利要求1所述的内生真菌转化反式茴脑生成异香兰酸的方法，其特征在于：包括如下步骤：

S1、将所述的假可可毛色二孢菌（Lasiodiplodia pseudotheobromae）BJEF32点种于PDA固体培养基上，置于28℃恒温培养箱中培养4d，待菌落长至4~5 cm，在超净工作台中用φ6mm无菌打孔器在菌落边缘打取菌饼，接种至含100 mL的液体培养基，每瓶接种10个菌饼，接种后于28℃、150 rpm摇床培养96 h，培养完毕，四层纱布过滤，菌体用0.05 mol/L pH7.0的 PBS（Na₂HPO₄-KH₂PO₄）缓冲液充分悬浮后洗涤2次，过滤抽干，将菌体摊于洁净滤纸上吸干菌体表面残留水分,得湿菌体；

S2、在100 mL三角瓶中，加入0.25~2.0 g步骤S1中的湿菌体，0.05 mol/L pH 6.0~8.0的 PBS缓冲溶液20 mL，辅助底物葡萄糖0.2~1.0 g，再加入0.2 mL 74~444 g/L反式茴脑的乙醇溶液，使其终浓度达0.74~4.44 g/L，置于摇床中150 rpm、20~40℃转化48 h;转化完毕，5000 r/min离心分离培养液和菌体细胞；

S3、将菌体细胞用乙酸乙酯洗涤两次；培养液用2.0M硫酸调节pH≤2后，用等体积的乙酸乙酯萃取两次；收集、合并乙酸乙酯洗涤液和萃取液，40℃下减压旋转蒸发除去大部分乙酸乙酯。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述步骤S1中，液体培养基的组成为：马铃薯250 g/L、葡萄糖20 g/L、pH 7.0、反式茴脑0.1 g/L。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述步骤S2中，转化条件为：温度30℃， pH6.0，菌体细胞浓度为50 g/L，反式茴脑浓度为1.48 g/L，辅助底物葡萄糖浓度为10 g/L。