[发明专利]一种以廉价底物生产亚精胺的方法及工程菌

说明书

本发明公开了一种以廉价底物生产亚精胺的方法及工程菌，属于生物工程技术领域。本发明构建了表达γ‑谷氨酸激酶、谷氨酸‑5‑半醛脱氢酶、天冬氨酸激酶、天冬氨酸‑β‑半醛脱氢酶、胺脱氢酶、L‑2,4双胺丁酸脱羧酶、羧基亚精胺脱氢酶、羧基亚精胺脱羧酶、葡萄糖脱氢酶、多聚磷酸盐激酶2‑I的重组细胞或者重组细胞的组合，并利用重组细胞或者重组细胞的组合催化天冬氨酸和精氨酸合成亚精胺。本发明选用的氧化还原酶类均能高效使用NAD(NADH)为辅酶、反应过程无产物反馈抑制，具有良好的工业化应用前景。

技术领域

本发明涉及一种以廉价底物生产亚精胺的方法及工程菌，属于生物工程技术领域。

背景技术

亚精胺(Spermidine)，线性分子式为NH₂(CH₂)₃NH(CH₂)₄NH₂，广泛存在于微生物、植物和动物体内，是一种重要的生理活性物质。亚精胺具有延长动物寿命的功效，并抵消与年龄相关的疾病，如心血管疾病，神经退行性疾病和癌症等。

如图1所示，生物体中主要有两条途径合成亚精胺：(1)经由羧基化腺苷甲硫氨酸和腐胺在亚精胺合成酶的作用下直接合成亚精胺，羧基化腺苷甲硫氨酸可由常见的甲硫氨酸(Met)，经过相关酶的腺苷化和脱羧化催化得到，该途径在动物、植物和微生物体内，是比较常见的传统亚精胺合成的途径；(2)经由天冬氨酸-β-半醛和腐胺在羧基亚精胺脱氢酶和脱羧酶的催化下合成亚精胺，天冬氨酸-β-半醛可经常见氨基酸如天冬氨酸(Asp)经相关酶的磷酸化和脱氢化催化合成，该途径为新发现的替代合成途径，主要存在于一些细菌中，包括重要的人类病原体，肠道菌群等。两条途径都涉及到重要的中间体-腐胺(Put)，腐胺可由常见的氨基酸-鸟氨酸(Orn)或精氨酸(Arg)经过相关酶催化合成得到，在亚精胺的合成过程中，是重要的中间底物。由于这些途径中的酶受到高度调控，动植物体的亚精胺含量较低，目前也未发现可以大量生产亚精胺的微生物。

发明内容

[技术问题]

本发明要解决的技术问题是以廉价化合物为底物合成亚精胺，尤其是构建多酶共表达的基因工程菌，利用该基因工程菌以L-谷氨酸与天冬氨酸，或L-谷氨酸与1,3-丙二胺为底物合成亚精胺，实现亚精胺的高效生产。

[技术方案]

本发明提供了一种以廉价氨基酸为底物合成亚精胺的方法，是以L-谷氨酸与1,3-丙二胺为底物合成亚精胺，L-谷氨酸被γ-谷氨酸激酶(gamma-glutamyl kinase)以ATP为辅酶催化生成谷氨酰-β-磷酸和ADP，L-谷氨酰-β-磷酸被谷氨酸-5-半醛脱氢酶(glutamate-5-semialdehyde dehydrogenase)以NADPH或NADH为辅酶催化生成L-谷氨酸半醛和NAD(NADP)；羧基亚精胺脱氢酶(Carboxyspermidine dehydrogenase)以NADPH或NADH为辅酶将L-谷氨酸半醛和1,3-丙二胺合成为异羧基亚精胺(2-amino-5-[(3-aminopropyl)amino]pentanoic acid)，辅酶再生为NAD(NADP)，最后羧基亚精胺脱羧酶(Carboxyspermidine decarboxylase)的突变体将异羧基亚精胺脱羧生成亚精胺；在以上过程中由葡萄糖脱氢酶(Glucose dehydrogenase)实现NADH(NADPH)的再生、由多聚磷酸盐激酶2-I(polyphosphate kinase 2-I,PPK2-I)实现ATP的再生。