[发明专利]一种基于S1酶切割的适配体截短优化方法

权利要求书

1.一种基于S1核酸酶切割的适配体截短优化方法，其特征在于，

以PD-L1为靶分子，以S1核酸酶为截短酶，通过以下技术方案实现：

1) 合成以下序列所示的PD-L1核酸适配体：

5’-GCT GTG TGA CTC CTG CAA GAC GGA CCA GCC TTG CCG CAA GAC GGA CCA GGGATT CAA ACG AGC AGC TGT ATC TTG TCT CC-3’；

2) 利用核酸酶酶切截短优化适配体，具体如下：

酶切截短优化过程所用试剂：2×蛋白结合液浓度组成为：100 mM磷酸钠，600 mMNaCl，0.02 % 吐温-20 ，pH8.0；1×蛋白结合液即把2×蛋白结合液稀释1倍；

SELEX结合液：150 mM NaCl，5 mM KCl，1 mM MgCl₂，1 mM CaCl₂，40 mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸，pH 7.4；

洗脱液：20 mM 三羟甲基氨基甲烷，500 mM 咪唑，pH 7.5；

5×反应液：200 mM 乙酸钠，1.5 M NaCl，10 mM ZnSO4 ，pH 4.5；

2.1 PD-L1蛋白重建

2.2 PD-L1蛋白和磁珠连接

2.2.1 取5 μL PD-L1蛋白溶液加入到700 μL 1×蛋白结合液中；

2.2.2 在小瓶中混匀磁珠

2.2.3 将50 μL磁珠转移到微离心管上，并放置在磁分离架上2分钟，抽吸并清除上清液；向磁珠中加入样品，混匀；

2.2.4 在37 ℃下在滚筒上孵育5分钟，孵育结束置于磁分离架2分钟，弃上清液；

2.2.5 取1×蛋白结合液洗涤磁珠-蛋白复合体3次，磁分离2分钟弃上清液；

2.3 适配体孵育

2.3.1 适配体溶于无菌水，95℃热变性5分钟，冰浴10分钟，与等体积SELEX结合液混匀；

2.3.2 加入到磁珠-蛋白质复合物中，混匀，室温下孵育30 分钟；

2.3.3 孵育结束磁分离去上清液，用PBS-T缓冲液清洗2次；

2.4 S1核酸酶酶切实验

2.4.1取2.3.3得到的磁珠复合物及S1核酸酶加入到1×反应液体系中，37 ℃反应30分钟，磁分离，用PBS-T洗涤2次，去上清液；

2.4.2 加入200 μL洗脱液，混合均匀，100℃沸水浴10分钟，磁分离，取上清液；

3）. 质谱分析

3.1 运用赛默飞LTQXL型线性离子阱质谱仪对2.4.2所得上清液分析；

3.2 对比质谱图与截短前序列，得到截短优化后序列为：5’-AAGACGGACCAGCCTTGCCGCAAGACGGACCAGGGATT-3’。

2.一种截短优化后序列，序列为：5’-AAGACGGACCAGCCTTGCCGCAAGACGGACCAGGGATT-3’。