[发明专利]一种基于S1酶切割的适配体截短优化方法

说明书

一种基于S1核酸酶切割的适配体截短优化方法属于医疗诊断领域。该方法包括磁珠和蛋白偶联(MP)、适配体和MP孵育(MPA)、S1核酸酶截短优化、质谱分析。适配体通过此方法实现序列长度的截短优化。基于空间位阻，核酸酶切割适配体与靶物结合紧密区段序列效率较低，该区段被大量保存并在质谱检测中呈现出较大的离子丰度。截短后序列与靶物PD‑L1蛋白的KD值比原序列下降54.67％，验证了该方法的可行性。本发明可为适配体的截短优化提供基于实验的方法，并可用于确定适配体与靶物的结合区域。

技术领域

本发明属于医疗诊断领域，特别涉及到利用核酸酶酶切优化已筛选适配体的方法。目前适配体的截短优化主要为软件计算模拟，很少涉及基于实验的直接截短优化。该方法可为适配体的截短优化提供实验方法，并为阐明适配体与靶物的相互作用机制提供依据。

背景技术

随着我国社会经济高速发展、人口老龄化进程加速，癌症已成为已经成为仅次于心血管疾病的高死亡率疾病。癌症是慢性病，早诊断早治疗对于提高患者生存率具有重大意义。肿瘤标志物检测是癌症早期发现、鉴别、预后的重要手段，而无论患者或健康者体内的肿瘤标志物含量是微量的，因此需要高灵敏的检测方法。目前，肿瘤标记物的检测学方法主要是利用蛋白间的特异性相互作用进行检测。程序性死亡配体1(PD-L1)是一种重要的肿瘤标记物，它是一种跨膜蛋白，在多种癌细胞上过量表达，为程序性细胞死亡受体1(PD-1)的主要配体。PD-L1蛋白在调节抗肿瘤宿主免疫中起着重要作用，使肿瘤细胞逃避宿主免疫系统并促进癌细胞转移。

抗体蛋白的表达纯化成本高昂且易失活，批次间差异大，对肿瘤标志物检测结果产生不良影响。核酸适配体是从DNA或RNA文库中筛选的、能与靶标物质高特异性结合的单链寡核苷酸序列。核酸适配体通过碱基对堆积、氢键、静电和疏水作用等与靶标物质特异性结合。与蛋白质相比，核酸适配体具有亲和力高、特异性强、分子量小、易合成易修饰、筛选周期短等优点，是蛋白质抗体的良好替代。

直接从文库中筛选得到的核酸适配体可能无法直接运用于成分复杂的待检体系，需要进一步截短优化。随着核酸的长度增加，由于意外的相互作用，它们有更大的机会被锁定成亚稳态非活性构象。核苷酸碱基堆积力允许非活性构象和活性构象分隔，这表明更短的核酸适配体具有较大变为活性构象的倾向。适配体截短主要通过软件进行分子对接模拟，根据模拟适配体-靶物作用位点进行序列截短。本发明以PD-L1为靶分子，以S1核酸酶为截短酶，基于适配体与靶物结合区域对酶切效率产生不利影响，在质谱检测中结合区域片段呈现出较大的离子丰度，而截短优化出亲和力更高的序列。

发明内容

本发明的目的在于克服现有适配体截短优化的不足，提供新型的适配体截短优化方法，相比于基于软件的分子动力学模拟，更具有事实性，并为阐明适配体与靶物的相互作用机制提供依据。本发明以PD-L1为靶分子，以S1核酸酶为截短酶，对已知适配体进行截短优化出亲和力更高的序列。

上述目的通过以下技术方案实现：

1.合成以下序列所示的PD-L1核酸适配体：

5’-GCT GTG TGA CTC CTG CAA GAC GGA CCA GCC TTG CCG CAA GAC GGA CCAGGG ATT CAA ACG AGC AGC TGT ATC TTG TCT CC-3’。

2.利用核酸酶切截短优化适配体

酶切截短优化过程所用试剂：2×蛋白结合液浓度组成为：100mM磷酸钠，600mMNaCl，0.02％吐温-20，pH8.0(1×蛋白结合液即把2×蛋白结合液稀释1倍)。

SELEX结合液：150mM NaCl，5mM KCl，1mM MgCl₂，1mM CaCl₂，40mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸，pH 7.4。

洗脱液：20mM三羟甲基氨基甲烷，500mM咪唑，pH 7.5。