[发明专利]外周血单个核细胞的分离方法在审
| 申请号： | 201910836499.2 | 申请日： | 2019-09-05 |
| 公开（公告）号： | CN110551686A | 公开（公告）日： | 2019-12-10 |
| 发明（设计）人： | 何美弟;江嘉豪;王进辉;于莉 | 申请（专利权）人： | 广东唯泰生物科技有限公司 |
| 主分类号： | C12N5/078 | 分类号： | C12N5/078 |
| 代理公司： | 44100 广州新诺专利商标事务所有限公司 | 代理人： | 许英伟 |
| 地址： | 528200 广东省佛山市南海*** | 国省代码： | 广东;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 下层 沉淀 外周血单个核细胞 血细胞 细胞沉淀 沉降 上清液 重悬 去除 淋巴细胞分离液 羟乙基淀粉溶液 预处理 红细胞裂解液 人血白蛋白 细胞悬液 再生医学 培养基 活性高 培养瓶 外周血 保留 分装 肝素 上层 采集 血液 | ||
1.一种外周血单个核细胞的分离方法，其特征在于，包括以下步骤：
预处理：将采集的外周血进行离心，分离上层血液和下层血细胞，将下层血细胞与羟乙基淀粉溶液混合，混合均匀后放置沉降，去除沉降后的上清液，保留下层沉淀；
分离：向下层沉淀中加入红细胞裂解液，混合均匀，离心，取细胞沉淀，加入PBS重悬，将细胞悬液加入到淋巴细胞分离液中，离心，去除上清液，保留细胞沉淀，加入PBS、肝素和人血白蛋白，混合，离心，得到PBMC细胞沉淀；
培养：用培养基重悬PBMC细胞沉淀，分装至培养瓶中进行培养。
2.根据权利要求1所述的外周血单个核细胞的分离方法，其特征在于，所述预处理步骤中：离心转速为1700～1900rpm，离心时间为8～12min。
3.根据权利要求2所述的外周血单个核细胞的分离方法，其特征在于，下层血细胞与羟乙基淀粉溶液的体积比为(3～5):1；沉降时间为50～70min。
4.根据权利要求3所述的外周血单个核细胞的分离方法，其特征在于，所述羟乙基淀粉溶液的浓度为20～40g/mL。
5.根据权利要求1所述的外周血单个核细胞的分离方法，其特征在于，所述预处理步骤中，采集外周血时，将外周血放置于肝素钠采血管中，采集完成后，将肝素钠采血管放置于密封无菌运输瓶中冷藏运输，冷藏温度为4～8℃。
6.根据权利要求1所述的外周血单个核细胞的分离方法，其特征在于，所述分离步骤具体为：向下层沉淀中加入红细胞裂解液，红细胞裂解液与下层沉淀的体积比为(0.8～1.2):1，混合均匀后放置于4±1℃下保存2～4min，离心，离心转速为1700～1900rpm，离心时间为8～12min，取细胞沉淀，加入PBS重悬，将细胞悬液加入到淋巴细胞分离液中，离心，离心转速为600～1000rpm，离心18～22min，去除上清液，保留细胞沉淀，加入PBS、肝素和人血白蛋白，混合均匀后置于4±1℃下保存2～4min，离心，离心转速为1700～1900rpm，离心时间为8～12min，得到PBMC细胞沉淀。
7.根据权利要求6所述的外周血单个核细胞的分离方法，其特征在于，所述肝素的工作浓度为0.2～1U/mL，人血白蛋白的工作浓度为10～30g/mL。
8.根据权利要求6所述的外周血单个核细胞的分离方法，其特征在于，所述淋巴细胞分离液为Ficoll淋巴细胞分离液。
9.根据权利要求8所述的外周血单个核细胞的分离方法，其特征在于，细胞悬液与Ficoll淋巴细胞分离液的体积比为5:(2～4)。
10.根据权利要求1所述的外周血单个核细胞的分离方法，其特征在于，所述培养步骤中，培养瓶为75cm2的培养瓶，培养环境中，湿度为饱和湿度，温度为37±0.5℃，CO2浓度为5.0％±0.5％。
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