[发明专利]外周血单个核细胞的分离方法

说明书

本发明提供一种外周血单个核细胞的分离方法，涉及再生医学领域。本发明的分离方法包括以下步骤：预处理：将采集的外周血进行离心，分离上层血液和下层血细胞，将下层血细胞与羟乙基淀粉溶液混合，混合均匀后放置沉降，去除沉降后的上清液，保留下层沉淀；分离：向下层沉淀中加入红细胞裂解液，混合均匀，离心，取细胞沉淀，加入PBS重悬，将细胞悬液加入到淋巴细胞分离液中，离心，去除上清液，保留细胞沉淀，加入PBS、肝素和人血白蛋白，混合，离心，得到PBMC细胞沉淀；培养：用培养基重悬PBMC细胞沉淀，分装至培养瓶中进行培养。采用本发明的方法，分离的外周血单个核细胞的数量多、纯度高、活性高。

技术领域

本发明涉及再生医学领域，特别是涉及一种外周血单个核细胞的分离方法及应用。

背景技术

外周血单个核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell,PBMC)即外周血中具有单个核的细胞，主要包括淋巴细胞(T淋巴细胞和B淋巴细胞)、单核细胞、吞噬细胞、树突状细胞和其他少量细胞类型，这些细胞是组成机体免疫应答功能的重要细胞。近年对外周血单个核细胞的研究越来越深入，研究发现外周血单个核细胞可以在体外增殖并定向分化。相比于从骨髓抽取免疫细胞，从外周血获取外周血单个核细胞，获取更容易，基本人体带来的痛苦。

2010年有研究显示CD80联合CD28/CpG ODN活化的PBMC对胃癌细胞杀伤作用。2014年另外一项研究从临床和实验方面探讨宫腔灌注外周血单个核细胞对胚胎着床的影响及其机制。可见，外周血单个核细胞有望成为一种新的疾病治疗手段。

目前，外周血单个核细胞的分离方法有很多种，但是制备得到的单个核细胞得率低、活性低，不利于其应用。因此，有必要开发一种新的分离外周血单个核细胞的方法，提高其分离效率和活性。

发明内容

基于此，有必要针对现有分离外周血单个核细胞的方法得率低、活性低的问题，提供一种外周血单个核细胞的分离方法。

一种外周血单个核细胞的分离方法，包括以下步骤：

预处理：将采集的外周血进行离心，分离上层血液和下层血细胞，将下层血细胞与羟乙基淀粉溶液混合，混合均匀后放置沉降，去除沉降后的上清液，保留下层沉淀；

分离：向下层沉淀中加入红细胞裂解液，混合均匀，离心，取细胞沉淀，加入PBS重悬，将细胞悬液加入到淋巴细胞分离液中，离心，去除上清液，保留细胞沉淀，加入PBS、肝素和人血白蛋白，混合，离心，得到PBMC细胞沉淀；

培养：用培养基重悬PBMC细胞沉淀，分装至培养瓶中进行培养。

上述分离方法，采用羟乙基淀粉溶液对血细胞进行沉降，采用红细胞裂解液裂解红细胞，采用淋巴细胞分离液分离单个核细胞，加入肝素抑制血小板的粘附聚集，有利于去除细胞悬液中留存的血小板，加入人血白蛋白维持血液渗透压和转运功能，以上各步骤组合使分离得到的外周血单个核细胞数量多、活性高。

在其中一个实施例中，所述预处理步骤中：离心转速为1700～1900rpm，离心时间为8～12min。

在其中一个实施例中，下层血细胞与羟乙基淀粉溶液的体积比为(3～5):1；沉降的时间为50～70min。

在其中一个实施例中，所述羟乙基淀粉溶液的浓度为20～40g/mL。

在其中一个实施例中，所述预处理步骤中，采集外周血时，将外周血放置于肝素钠采血管中，采集完成后，将肝素钠采血管放置于密封无菌运输瓶中冷藏运输，冷藏温度为4～8℃。