[发明专利]一种分离高耐镉的硫酸盐还原菌的方法

说明书

本发明公开了一种分离高耐镉的硫酸盐还原菌的方法，包括下述步骤：步骤1)将来源于镉污染场地的硫酸盐还原菌样品激活；步骤2)分离纯化硫酸盐还原菌样品；步骤3)耐受镉的菌种筛选；步骤4)对高耐受镉的菌进行耐氧驯化；步骤5)实验室小试。

技术领域

本发明涉及菌种分离技术领域，特别涉及一种分离高耐镉的硫酸盐还原菌的方法。

背景技术

硫酸盐还原菌(Soulfate-Reducing Bacteria,简称SRB)是一种厌氧的微生物。广泛存在于土壤、海水、河水、地下管道以及油气井等缺氧环境中。研究表明在无氧或极少氧情况下，它能利用金属表面的有机物作为碳源，并利用细菌生物膜内产生的氢，将硫酸盐还原成硫化氢，从氧化还原反应中获得生存的能量。

我国南方地区农田重金属镉污染严重，农产品镉含量严重超标。由于镉为有毒元素，其化合物毒性更大。自然界中，镉的化合物具有不同的毒性。硫化镉、硒磺酸镉的毒性较低，氧化镉、氯化镉、硫酸镉毒性较高。但现今改良剂产品存在问题，土壤改良效果不佳，改良效果受外界环境因素影响较大，不能很好的降低土壤中硫酸镉含量。因此可以采用生物修复的方法，使用高耐镉的硫酸盐还原菌来对镉污染场地进行土壤治理与改良。

现有的分离硫酸盐还原菌的方法多采用充氮气的方法，保持培养体系内是严格厌氧，或者是在二氧化碳培养箱内进行培养。分离纯化出来的菌在接种到含有金属离子的培养基中，进行选择性筛选。筛选分为初筛和复筛，初筛的目的是筛选出具有该功能的菌株，复筛的目的是为了筛选功能性比较强有代表性的菌株。但目前严格厌氧的条件在实验室内很容易做到，但实际生产中不好实现，所以要进行方法的改进，并对菌株做一定的耐氧驯化。

发明内容

现有技术的客观缺点：在培养和分离纯化硫酸盐还原菌时，严格厌氧的条件在实验室内很容易做到，但实际生产中不好实现，如果增菌不到位则很容易让其他优势菌占位，硫酸盐还原菌便无法得以生长。因此本发明提出了如下技术方案：

一种分离高耐镉的硫酸盐还原菌的方法，包括下述步骤：

步骤1，将来自于镉污染场地的硫酸盐还原菌样品接种培养瓶中，进行三次增菌培养；

步骤2，对第三次增菌的培养瓶内取样进行平板划线分离，在厌氧环境中恒温培养，挑取黑色菌落，然后再进行分离纯化3-5次，通过显微镜初步判断纯度；

步骤3，将纯化的硫酸盐还原菌接种到液体培养基中恒温厌氧培养，然后接种于一系列不同镉浓度梯度的硫酸盐还原菌液体培养基中，恒温静置培养；

步骤4，在逐渐减弱的厌氧环境下培养；

步骤5，用镉污染的土壤作为培养基，将培养液包埋在污染土壤中，定期测定土壤样品中的镉含量。

优选地，在所述步骤1中，所述培养瓶内所采用的培养基为硫酸盐还原菌专用培养基。

优选地，所述步骤1，进一步为：所述的三次增菌培养中，第一次采用不灭菌的硫酸盐还原菌专用培养基，且接种量不低于10％；第二次和第三次采用灭菌的硫酸盐还原菌专用培养基。

优选地，所述步骤2中，所述厌氧环境通过厌氧袋和产气包获得

优选地，所述步骤2中，所述恒温培养的温度为30-35℃。

优选地，所述步骤3中，所述不同镉浓度梯度为25mg/L～100mg/L。优选地，在所述步骤3中所述恒温厌氧培养的时长为7天。

优选地，所述步骤3，进一步为：所述恒温厌氧培养后的菌液以5％的接种量接种于一系列不同镉浓度梯度的硫酸盐还原菌液体培养基中。

优选地，所述步骤4，进一步为：通过去除厌氧袋并减少培养瓶中液体培养基的体积来逐渐减弱厌氧环境。