[发明专利]一种待测样品中具有poly(A)尾巴的RNA的测序文库的构建方法

权利要求书

1.待测样品中具有poly（A）尾巴的RNA的测序文库的构建方法，依次包括如下步骤：

（a1）取待测样品的总RNA，使用引导引物和Klenow片段进行末端延伸，然后加入USER酶充分消化，回收长度为200nt以上的核酸片段；

引导引物从5’末端至3’末端依次包括DNA片段甲和DNA片段丙；

DNA片段甲为15-40bp的任意序列且不能与poly（A）尾巴结合，用于PCR扩增；

DNA片段丙由3-24bp核苷酸组成，每个核苷酸为dU或T；DNA片段丙5’末端的3个核苷酸中至少一个为dU；

（a2）取所述核酸片段，用RT引物和具有末端转移酶活性的反转录酶进行反转录，得到cDNA；

RT引物是DNA片段甲的核苷酸序列的全部；

（a3）取所述cDNA，用TSO进行模板交换；

TSO从5’末端至3’末端依次包括DNA片段丁和核酸片段丁；

DNA片段丁为15-40bp的任意序列，用于PCR扩增；

核酸片段丁包括区段2，区段2用于和所述cDNA结合；区段2由N个鸟嘌呤核糖核苷酸组成或者由（N-1）个鸟嘌呤核糖核苷酸和1个进行了锁核酸修饰的鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸组成，N为3以上的自然数；

（a4）取完成步骤（a3）的cDNA，采用PCR引物进行PCR扩增，获得扩增cDNA；

PCR引物中的上游引物是DNA片段丁的核苷酸序列的全部；

PCR引物中的下游引物是DNA片段甲的核苷酸序列的全部；

（a5）取所述扩增cDNA，测序；获得待测样品中具有poly（A）尾巴的RNA的测序文库。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（a1）中，所述引导引物还包括DNA片段乙，DNA片段乙位于DNA片段甲的3’端、DNA片段丙的5’端；DNA片段乙为8-30bp的Barcode序列，用于区分不同的待测样品。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（a3）中，所述核酸片段丁包括区段1，区段1位于区段2的5’端；所述区段1为0-10bp的任意序列。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（a3）中，所述DNA片段丁为DNA片段甲。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（a5）中，扩增cDNA测序为：将大于200bp的扩增cDNA和大于2kb的扩增cDNA混合，之后采用SMRTbell Template Prep试剂盒构建SMRTbell Template文库；采用PacBio平台对SMRTbell Template文库进行测序。