[发明专利]一种待测样品中具有poly(A)尾巴的RNA的测序文库的构建方法

说明书

本发明公开了一种待测样品中具有poly(A)尾巴的RNA的测序文库的构建方法。该方法包括如下步骤：取待测样品的总RNA，使用引导引物进行末端延伸，然后用USER酶充分消化，回收长度为200nt以上的核酸片段；将核酸片段进行反转录，然后用TSO进行模板交换，得到cDNA；取所述cDNA，采用PCR引物进行PCR扩增，获得扩增cDNA；取所述扩增cDNA，构建测序文库，最后上机测序。实验证明，采用本发明提供的方法构建的测序文库可以分析具有poly(A)尾巴的RNA的序列，包括poly(A)尾巴的序列。本发明对于RNA的poly(A)尾巴的研究具有重要的应用价值。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种待测样品中具有poly(A)尾巴的RNA的测序文库的构建方法。

背景技术

大部分信使RNA(mRNA)和长链非编码RNA(long intergenic non-coding RNA，lincRNA)等成熟RNA常常会受到众多转录后修饰调控。在poly(A)聚合酶的催化下，大多数的mRNA和lincRNA在转录的同时被加上了无模版的poly(A)尾巴。poly(A)尾巴被认为是调控RNA稳定性和转录效率的关键因子之一。具有poly(A)的mRNA和lincRNA仅占胞内RNA中的一小部分。Oligo(dT)依赖的亲和纯化是分离mRNA的常用方法，但该方法对于较长的poly(A)尾巴具有不可避免的偏好性。因而，在分析poly(A)尾巴的时候，需要尽量避免poly(A)的偏向性富集来得到原始真实的poly(A)信息。

进入高通量测序(next generation sequencing，NGS)时代之后，转录组相关研究层出不穷。但现有NGS技术运用的碱基识别算法无法处理长于30nt的均聚序列，poly(A)尾巴的具体碱基组成还未能得到很好的阐释。即便是Sanger测序法也很难识别较长的均聚序列。Smart-seq2是一种极为灵敏的单细胞RNA-seq技术，该技术可以通过3’UTR的锚定引物5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT30VN-3’(N代表任意碱基，V代表A、C或G)进行反转录以及cDNA文库的构建。该引物末端的N和V可将其锚定到3’UTR的末端，通过数据分析从最终的cDNA文库中去除poly(A)尾巴，排除均聚序列的对序列组装的影响。Illumina平台的另一些RNA-seq工具也可以在文库构建、测序和数据分析过程中去除poly(A)的影响。基于PacBio平台的Iso-seq技术可以利用类似于Smart-seq2的策略，从剔除poly(A)的cDNA中构建文库。因此，Illumina/PacBio平台产生的常规RNA-seq或者Iso-seq数据均缺失poly(A)信息。