[发明专利]一种连续流固定化甲酰甘氨酸生成酶反应器及其使用方法与应用

说明书

本发明公开了一种连续流固定化甲酰甘氨酸生成酶反应器及其使用方法与应用，属于固定化酶技术领域。用于蛋白的定点醛基化修饰。本发明通过将甲酰甘氨酸生成酶固载到琼脂糖凝胶上，显著提高了其稳定性，简化了产物分离。通过发明一种固定化酶的原位重构方法，使得固定化甲酰甘氨酸生成酶能够连续使用，且反应体系中无需再加入铜离子，从而简化了反应体系，降低了应用成本。将固定化甲酰甘氨酸生成酶应用于连续流反应器，提高了固定化酶的催化效率，实现了自动化的连续催化，具有过程可控、产物均一等优点，具有较大的工业放大潜力。

技术领域

本发明涉及一种连续流固定化甲酰甘氨酸生成酶反应器及其使用方法与应用，属于固定化酶技术领域。

背景技术

蛋白质定点修饰是蛋白质工程中的核心技术，在生物工程领域和生物医药领域有着广泛的应用。由于醛基具有优异的生物正交反应特性，蛋白质的定点醛基化修饰是蛋白质修饰领域的重要组成部分。甲酰甘氨酸生成酶(formylglycine generating enzyme，FGE)是一种蛋白质高效定点醛基化修饰工具。如图1所示，其通过识别融合在蛋白特定位点的醛基标签“CXPXR”，并催化其中的半胱氨酸(Cys)转化为甲酰甘氨酸(fGly)从而产生醛基。目前FGE已被开发为一种蛋白质定点修饰工具，如美国实用新型专利US20080187956A1首次公开了FGE用于蛋白质定点醛基化修饰的技术，美国发明专利US20160230205A1公开了FGE进行体内和体外进行高效醛基转化的技术。然而，目前FGE的体外应用主要局限于其较低的稳定性，较高的制备和使用成本，以及复杂的反应体系，这些因素使得FGE难以应用于大规模的工业生产。

固定化酶反应器是一种将酶固载到载体基质上，并利用固相催化实现产物转化的技术。固定化酶相比于游离酶具有稳定性高、产物易分离等优点。固定化酶反应器分为批式反应器和连续流反应器。连续流反应器是指将底物流经固定化酶反应器，从而在流动的条件下获得产物的技术。连续流反应器具有过程自动化可控、在线分离、传质效果好等优点，目前已被广泛应用于工业生产中。

发明内容

本发明要解决的技术问题是将连续流固定化酶反应器应用于蛋白的定点醛基化修饰，从而提供一种用于稳定高效，成本更低，更易用于工业生产放大的蛋白质定点醛基化修饰的固定化酶反应器。

为解决上述技术问题，本发明提供了一种连续流固定化甲酰甘氨酸生成酶反应器，包括泵和反应腔体，所述反应腔体中填装有固定化甲酰甘氨酸生成酶，所述固定化甲酰甘氨酸生成酶是将甲酰甘氨酸生成酶固定到载体基质上，在连续流反应时，反应溶液中还加入了还原剂。

进一步地，上述技术方案中，所述泵包括微量蠕动泵、高效液相泵、注射泵。

进一步地，上述技术方案中，所述甲酰甘氨酸生成酶包括来源于结核分枝杆菌的甲酰甘氨酸生成酶、来源于天蓝色链霉菌的甲酰甘氨酸生成酶、来源于弯曲高温单胞菌的甲酰甘氨酸生成酶。

进一步地，上述技术方案中，所述载体基质包括环氧活化的琼脂糖微球、四氧化三铁磁性微球、二氧化硅微球。

进一步地，上述技术方案中，所述反应溶液中加入的还原剂包括二硫苏糖醇、巯基乙醇、三(2-羧乙基)膦、巯基乙胺。

本发明还提供了一种连续流固定化甲酰甘氨酸生成酶反应器的使用方法，包括如下步骤：

(1)启动泵，使反应缓冲液冲洗反应腔体；

(2)将带有醛基标签的样品溶于反应缓冲液中并加入还原剂，然后泵入连续流固定化甲酰甘氨酸生成酶反应器反应腔体，使样品流经反应器，收集反应器流出的液体，即得到醛基化修饰后的样品。

进一步地，上述技术方案中，所述步骤(1)中反应缓冲液为50mM三乙醇胺，pH 9.0，50mM氯化钠。

进一步地，上述技术方案中，所述步骤(2)中样品流经反应器的保留时间大于4分钟。