[发明专利]检测斜纹夜蛾成虫带核型多角体病毒的巢式PCR引物、试剂盒及其方法

权利要求书

1.一种检测斜纹夜蛾成虫带核型多角体病毒的巢式PCR引物，其特征在于：所述引物包括一对外侧引物egt-F、egt-R，以及一对内侧引物egt1-F、egt1-R，其引物序列如下：

egt-F：5'-TCGAAACGTTTGGGATCTACAGT-3'；

egt-R：5'-ACTGTCAATATTTCGACGAGCCT-3'；

egt1-F：5'-GCAGCTGCAAATCAAAGAAAATCC-3'；

egt1-R：5'-TCAATATTTCGACGAGCCTACGA-3'。

2.一种检测斜纹夜蛾成虫带核型多角体病毒的巢式PCR试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的检测斜纹夜蛾成虫带核型多角体病毒的巢式PCR引物。

3.根据权利要求2所述的检测斜纹夜蛾成虫带核型多角体病毒的巢式PCR试剂盒，其特征在于：

所述的检测斜纹夜蛾成虫带核型多角体病毒的巢式PCR引物的浓度均为20μM。

4.根据权利要求2所述的检测斜纹夜蛾成虫带核型多角体病毒的巢式PCR试剂盒，其特征在于：还包括碱解液，扩增试剂和RNase Free dH2O中的至少一种；

所述的碱解液由以下组分组成：0.2mol/L Na₂CO₃,0.02mol/L EDTA,0.34mol/L NaCl；

所述的扩增试剂包括Taq DNA聚合酶。

5.权利要求1所述的检测斜纹夜蛾成虫带核型多角体病毒的巢式PCR引物或权利要求2～4任一项所述的检测斜纹夜蛾成虫带核型多角体病毒的巢式PCR试剂盒在检测斜纹夜蛾核型多角体病毒中的应用。

6.一种检测斜纹夜蛾成虫带核型多角体病毒的巢式PCR方法，其特征在于：为利用权利要求1所述的检测斜纹夜蛾成虫带核型多角体病毒的巢式PCR引物或权利要求2～4任一项所述的检测斜纹夜蛾成虫带核型多角体病毒的巢式PCR试剂盒进行两轮PCR扩增，检测样品中是否含有斜纹夜蛾核型多角体病毒。

7.根据权利要求6所述的检测斜纹夜蛾成虫带核型多角体病毒的巢式PCR方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

(1)病毒样品DNA提取

将待测病毒样品先加入碱解液进行裂解，然后再提取样品DNA；

(2)第一轮PCR扩增

以步骤(1)提取的DNA为模板，利用外侧引物egt-F和egt-R进行第一轮PCR扩增，得到PCR扩增产物；然后将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，若扩增出380bp大小的目的条带，则为阳性，否则为阴性；

(3)以第一轮PCR扩增得到的产物为模板，利用内侧引物egt1-F和egt1-R进行第二轮PCR扩增，得到第二轮PCR扩增产物；然后将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，若扩增出190bp的电泳条带，则证明所述样品中存在斜纹夜蛾核型多角体病毒。

8.根据权利要求7所述的检测斜纹夜蛾成虫带核型多角体病毒的巢式PCR方法，其特征在于：

步骤(1)中所述的碱解液由以下组分组成：0.2mol/L Na₂ CO₃,0.02mol/L EDTA,0.34mol/L NaCl。

9.根据权利要求7所述的检测斜纹夜蛾成虫带核型多角体病毒的巢式PCR方法，其特征在于：

步骤(2)和(3)中所述的PCR反应体系为：Premix Taq12.5μl，20μM的正向egt-F、egt1-F和反向引物egt-R、egt1-R各1μl，DNA模板1μl，补加RNase Free dH2O至25μl。

10.根据权利要求7所述的检测斜纹夜蛾成虫带核型多角体病毒的巢式PCR方法，其特征在于：

步骤(2)所述的PCR的反应条件为：94℃预变性3min，94℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸60s，35个循环，72℃延伸10min；

步骤(3)所述的PCR的反应条件为：94℃预变性3min，94℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环，72℃延伸10min。