[发明专利]检测斜纹夜蛾成虫带核型多角体病毒的巢式PCR引物、试剂盒及其方法

说明书

本发明公开了一种检测斜纹夜蛾成虫带核型多角体病毒的巢式PCR引物、试剂盒及其方法。本发明针对egt基因设计了一对外侧引物egt‑F、egt‑R，以及一对内侧引物egt1‑F、egt1‑R，其引物序列如SEQ ID NO.1～4所示，其具有针对SpltNPV病毒的特异性。本发明还提供了一种检测斜纹夜蛾成虫带核型多角体病毒的巢式PCR试剂盒，具有特异性强、灵敏度高、实用性强等特点。本发明利用该引物或试剂盒经过两轮PCR扩增，比两轮普通PCR检测方法灵敏度提高2个数量级，该方法适用于检测斜纹夜蛾成虫带毒检测。

技术领域

本发明涉及分子诊断技术领域，特别涉及一种检测斜纹夜蛾成虫带核型多角体病毒的巢式PCR引物、试剂盒及其方法。

背景技术

斜纹夜蛾核型多角体病毒(Spodoptera litura Nucleopolyhedrovirus,SpltNPV)属杆状病毒科，是斜纹夜蛾的重要病原微生物，对斜纹夜蛾种群具有良好的控制作用，可侵染幼虫发病，使幼虫虫体死亡腐烂；可通过成虫口器进入其体内，影响成虫寿命、产卵量和下一代生长发育。

病毒检测分析是其毒力、流行学研究的必要手段。在SpltNPV病毒分子检测方面，目前一般采用特异片段常规聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)分析，这种方法对感染SpltNPV而发病幼虫可以非常容易扩增到特异片段；但对于检测带毒成虫，通过采用常规PCR方法扩增，凝胶电泳无法检测到特异扩增片段，推测可能因为成虫携带病毒量太微量，病毒在成虫体内增殖较慢。

SpltNPV病毒的蜕皮甾体尿苷二磷酸葡萄糖转移酶(ecdysteroid UDP-glucosyltransferase,egt)基因序列高度保守，可以作为分子检测的靶基因，其特异引物egt-F/R采用普通PCR一轮扩增和二轮扩增均难有效扩增出斜纹夜蛾成虫带毒的特异片段。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种检测斜纹夜蛾成虫带核型多角体病毒的巢式PCR引物。

本发明的另一目的在于提供一种检测斜纹夜蛾成虫带核型多角体病毒的巢式PCR试剂盒。

本发明的再一目的在于提供一种检测斜纹夜蛾成虫带核型多角体病毒的巢式PCR方法。其具有特异性强、灵敏度高的特点，适用于斜纹夜蛾成虫带毒的分子检测，具有重要科学研究意义。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种检测斜纹夜蛾成虫带核型多角体病毒的巢式PCR引物，所述引物包括一对外侧引物egt-F、egt-R，以及一对内侧引物egt1-F、egt1-R，其引物序列如下：

egt-F：5'-TCGAAACGTTTGGGATCTACAGT-3'(SEQ ID NO.1)；

egt-R：5'-ACTGTCAATATTTCGACGAGCCT-3'(SEQ ID NO.2)；

egt1-F：5'-GCAGCTGCAAATCAAAGAAAATCC-3'(SEQ ID NO.3)；

egt1-R：5'-TCAATATTTCGACGAGCCTACGA-3'(SEQ ID NO.4)。

一种检测斜纹夜蛾成虫带核型多角体病毒的巢式PCR试剂盒，包括上述检测斜纹夜蛾成虫带核型多角体病毒的巢式PCR引物。

所述的检测斜纹夜蛾成虫带核型多角体病毒的巢式PCR引物的浓度均为20μM。

所述的检测斜纹夜蛾成虫带核型多角体病毒的巢式PCR试剂盒还包括碱解液，扩增试剂和RNase Free dH₂O中的至少一种。

所述的扩增试剂包括Taq DNA聚合酶；优选为Premix Taq(TakaRa TaqTMVeresion 2.0plus dye)。