[发明专利]MTHFR和MTRR基因多态性检测引物、探针、试剂盒及应用

权利要求书

1.一种MTHFR和MTRR基因多态性检测引物和探针组合，其特征在于，所述组合包括：

(1)MTHFR C677T基因多态性检测引物与探针组合：包括核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示的MTHFR C677T上游引物、核苷酸序列为SEQ ID NO:2所示的MTHFR C677T下游引物、核苷酸序列为SEQ ID NO:7所示的MTHFR C677T 677C检测探针、核苷酸序列为SEQ ID NO:8所示的MTHFR C677T 677T检测探针；

(2)MTHFR A1298C基因多态性检测引物与探针组合：包括核苷酸序列为SEQ ID NO:3所示的MTHFR A1298C上游引物、核苷酸序列为SEQ ID NO:4所示的MTHFR A1298C下游引物、核苷酸序列为SEQ ID NO:9所示的MTHFR A1298C 1298A检测探针、核苷酸序列为SEQ ID NO:10所示的MTHFR A1298C 1298C检测探针；和

(3)MTRR A66G基因多态性检测引物与探针组合：包括核苷酸序列为SEQ ID NO:5所示的MTRR A66G上游引物、核苷酸序列为SEQ ID NO:6所示的MTRR A66G下游引物、核苷酸序列为SEQ ID NO:11所示的MTRR A66G 66A检测探针、核苷酸序列为SEQ ID NO:12所示的MTRRA66G 66G检测探针；

其中，所述检测探针的5′端标记有FAM或HEX，3′端标记有NFQ-MGB。

2.一种MTHFR和MTRR基因多态性检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

如权利要求1所述的基因多态性检测引物和探针组合；

内标系统；

核酸释放剂；和

2×PCR反应混合液。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述内标系统包括内标引物和内标探针，所述内标引物包括核苷酸序列为SEQ ID NO:13所示的GAPDH上游引物和SEQ ID NO:14所示的GAPDH下游引物，所述内标探针包括核苷酸序列为SEQ ID NO:15所示的检测探针，其中，所述内标探针5′端修饰有ROX荧光基团，3′端修饰有BHQ2。

4.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于，所述核酸释放剂包括：终浓度为0.1～5％体积分数NP40、100～200mmol/L KCl、5～20mmol/L EDTA、10～20％体积分数BSA、10～30％体积分数DMSO，且所述核酸释放剂的pH值为7.0～8.5；

优选地，所述核酸释放剂包括：终浓度为1％体积分数NP40、150mmol/L KCl、10mmol/LEDTA、15％体积分数BSA、20％体积分数DMSO，且所述核酸释放剂的pH值为8.2。

5.根据权利要求2至4中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括三个PCR反应管，其中，每个PCR体系中含有2×PCR反应混合液、如权利要求1所述的引物与探针组合和内标系统。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述每个PCR体系中PCR反应混合液的体积为10μl，所述各引物的体积为0.1μM～1μM，所述各探针的终浓度为50nM～250nM；

优选地，各引物的终浓度为0.1μM，所述各探针的终浓度为100nM。

7.一种MTHFR和MTRR基因多态性检测方法，其特征在于，使用权利要求2至6中任一项所述的试剂盒，所述方法包括以下步骤：

(1)将待测样本加入到所述核酸释放剂中，涡旋充分混匀，室温放置1～30分钟优选为5分钟，瞬时离心备用；

(2)配置PCR反应体系，每个样本的MTHFR和MTRR基因多态性分3管检测；

(3)将配置好的PCR体系放入荧光定量PCR仪中，进行实时荧光定量检测。