[发明专利]MTHFR和MTRR基因多态性检测引物、探针、试剂盒及应用

说明书

本发明提供了一种MTHFR和MTRR基因多态性检测引物和探针组合，包括MTHFR C677T、MTHFR A1298C、MTRR A66G基因多态性检测引物与探针组合。本发明还提供了一种MTHFR和MTRR基因多态性的检测试剂盒，所述试剂盒包括以下组分：核酸释放剂，2×PCR反应混合液(包含热启动Taq DNA聚合酶、UDG酶)，3组特异性引物，3组特异性探针和内标系统。本试剂盒仅需在常温下对2μl血液样本进行短暂处理便可得到用于多次检测的高质量DNA；检测特异性好，与金标准测序法符合率为100％；灵敏度高，可对0.2ng基因组DNA准确分型；检测流程耗时短，从样本处理到检测结果可在1小时内完成。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种MTHFR和MTRR基因多态性快速检测引物、探针、试剂盒及其应用。

背景技术

叶酸是一种水溶性B族维生素，是合成核酸所必须的元素，是细胞生长和组织修复所必需的物质，更是胚胎发育过程中不可缺少的营养素。叶酸代谢通路中的关键酶活性降低会导致低叶酸血症和高同型半胱氨酸血症，是新生儿出生缺陷、孕妇妊娠高血压、自发性流产、男性精子质量下降、H型高血压、动脉粥样硬化和冠心病的重要危险因素之一。

5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)和甲硫氨酸合成酶还原酶(MTRR)是影响叶酸代谢的关键酶，其基因的多态性造成个体间叶酸利用能力差异，包括MTHFR基因的C677T、A1298C和MTRR基因的A66G多态性。MTHFR基因C677T位点的CC、CT、TT基因型在中国人群中的所占的比例分别为22％、50％、28％；A1298C位点的AA、AC、CC基因型在中国人群中所占的比例分别为66％、31％、4％；MTRR基因A66G位点的AA、AG、GG基因型在中国人群中所占的比例分比为58％、36％、6％。通过检测MTHFR基因和MTRR基因多态性，指导个体根据自身基因型合理准确地制定叶酸增补计划，预防因叶酸缺乏导致的相关疾病的发生。

目前用于MTHFR和MTRR基因多态性检测的方法主要有DNA测序法、基因芯片法、高分辨率熔解曲线法(HRM)、荧光定量PCR法。其中，DNA测序法是突变检测金标准，但此方法存在操作复杂、检测周期长、容易污染、成本高等缺点；基因芯片法芯片制备难度高、操作繁琐、检测成本昂贵；HRM法对设备要求高，需配置专门分析软件，限制了该方法的普及；传统荧光定量PCR法在临床上应用较为广泛，但该方法一般采用Genotyping方法进行基因分型，对样本数量以及多态性分布有一定要求，样本量少时不能对样本基因多态性进行准确分型。此外，以上检测方法使用的模板DNA均需要经过繁琐的提取和纯化步骤，不仅操作耗时、成本高，而且容易导致核酸损失并造成样本间交叉污染。因此，需要建立一种快速有效的检测少量样本MTHFR和MTRR基因多态性的方法。

发明内容

因此，本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种MTHFR和MTRR基因多态性检测引物、探针、试剂盒及应用。

在阐述本发明内容之前，定义本文中所使用的术语如下：

术语“MTHFR”是指：5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶。

术语“MTRR”是指：甲硫氨酸合成酶还原酶。

术语“PCR”是指：聚合酶链式反应。

术语“FAM”是指：6-羧基荧光素。

术语“HEX”是指：六氯-6-甲基荧光素。

术语“ROX”是指：羧基-X-罗丹明。

术语“NFQ”是指：非荧光淬灭基团。

术语“MGB”是指：小沟结合物。

术语“BHQ2”是指：荧光淬灭基团。

术语“NP40”是指：乙基苯基聚乙二醇。