[发明专利]用葡萄糖合成甘氨酸的大肠杆菌重组菌的构建及应用

权利要求书

1.一种大肠杆菌重组菌，所述菌株包括如下修饰:

1）引入外源的谷氨酸乙醛酸转氨酶基因cgaT；

2）引入外源苹果酸硫激酶基因mtk，引入外源苹果酰辅酶A裂解酶裂解酶基因mcl；

3）引入乙醛酸途径aceK基因，即异柠檬酸脱氢酶激酶/磷酸酶的基因；

4）敲除aceB基因，即苹果酸合酶A的基因；

5）敲除iclR基因，即乙醛酸途径转录抑制因子的基因；

6）敲除glcB基因，即蛋白质苹果酸合酶G的基因；

7）敲除maeA基因，即苹果酸脱氢酶的基因；

8）敲除maeB基因，即苹果酸脱氢酶的基因。

2.一种构建权利要求1所述的大肠杆菌重组菌的方法，其制备步骤如下：

1) 构建两种质粒，其中一种为谷氨酸乙醛酸转氨酶II基因cgaT的质粒pLB1k-cgaT，另一种为苹果酸硫激酶、苹果酰辅酶A裂解酶异柠檬酸裂解酶和异柠檬酸脱氢酶激酶的重组质粒pSB1a-mtk-mcl-aceAK；

2）构建宿主菌，将受体菌XY24的苹果酸合酶A基因aceB敲除，形成重组菌GC01；将重组菌GC01的乙醛酸途径转录抑制因子基因iclR敲除，形成重组菌GC02；将重组菌GC02的苹果酸合酶G基因glcB敲除，形成重组菌GC03；将重组菌GC03的苹果酸脱氢酶基因maeA敲除，形成重组菌GC04；将重组菌GC04的苹果酸脱氢酶基因maeB敲除，形成重组菌GC05；

3）将重组菌GC05制备感受态细胞，将步骤1）中的质粒pLB1k-cgaT导入GC05，形成重组菌GC06；将菌株GC06制备感受态细胞，将步骤1）的pSB1a-mtk-mcl-aceAK导入到GC06，构建成利用葡萄糖合成甘氨酸的大肠杆菌重组菌GC07。

3.如权利要求2所述的大肠杆菌重组菌的构建方法，其特征在于：所述谷氨酸乙醛酸转氨酶II基因cgaT的质粒pLB1k-cgaT来源于藜麦Chenopodium quinoa；所述苹果酸硫激酶基因mtk来源于Methylococcus capsulatus，苹果酰辅酶A裂解酶裂解酶基因mcl来源于Rhodobacter sphaeroides；异柠檬酸裂解酶、异柠檬酸脱氢酶激酶/磷酸酶的重组质粒pSB1a-mtk-mcl-aceAK来源于大肠杆菌。

4.如权利要求2所述的大肠杆菌重组菌的构建方法，其特征在于：感受态细胞转化主要采用氯化钙法。

5.一种用权利要求1-4任一项所述的重组大肠杆菌以葡萄糖为原料制备甘氨酸的方法，其包括以下步骤：

1）菌体的培养和酶的诱导：将重组大肠杆菌GC07菌株从甘油保藏管中转接到5 mL LB培养基中37℃及220 rpm培养过夜，转接于含50mL ZYM自诱导培养基，加入卡那霉素及氨苄青霉素，使其终浓度分别为为50μg/mL和100μg/mL，30℃诱导培养16h后，测定O.D.₆₀₀光吸收值，并收集1.5×10¹¹菌体；

2）全细胞催化转化：将上述收集的菌体，4℃，5000rpm离心10min，用0.85%生理盐水洗涤两次，弃上清后，将菌体用5mL转化液重悬，转移到试管，使其最终菌浓度为3×10¹⁰/mL，进行全细胞转化合成甘氨酸，全细胞转化体系中含有终浓度50 mM的葡萄糖及1×PBS，转化条件为37℃、200rpm。