[发明专利]用葡萄糖合成甘氨酸的大肠杆菌重组菌的构建及应用

说明书

本发明公开了一种用葡萄糖合成甘氨酸的大肠杆菌重组菌的构建及应用。本发明公开了一种大肠杆菌重组菌，首先通过构建谷氨酸乙醛酸转氨酶II基因cgaT的质粒pLB1k‑cgaT(Cqu)和苹果酸硫激酶、苹果酰辅酶A裂解酶和异柠檬酸裂解酶、异柠檬酸脱氢酶激酶/磷酸酶的重组质粒pSB1a‑mtk(Mca)‑mcl(Rsp)‑aceAK，再通过敲除抑制基因构建宿主菌GC05，再通过将质粒pLB1k‑cgaT(Cqu)导入GC05，形成重组菌GC06，最终将质粒pSB1a‑mtk(Mca)‑mcl(Rsp)‑aceAK导入GC07，得到大肠杆菌重组菌GC07。本发明还给出用大肠杆菌重组菌GC07将葡萄糖转化为甘氨酸的方法。本发明方法具有转化率高，成本低，反应简单，污染小等特点。

技术领域

本发明涉及工业微生物的生物技术以及生物化工领域，具体涉及一种以葡萄糖为底物合成甘氨酸的重组大肠杆菌工程菌株的构建和应用。

背景技术

近些年，合成生物学与代谢工程的发展为大肠杆菌工程菌改造提供了有利条件，通过对野生菌进行定向进化以及合理的遗传改造，可以将廉价的底物转化为高附加值的化学品、燃料以及高分子聚合物。

甘氨酸(英文名为Glycine)又名氨基乙酸，是结构最简单的α-氨基酸。它是一种非常重要的精细化工合成中间体，在医药、食品、农药以及饲料添加剂等领域都有广泛应用。甘氨酸目前常用于以下几个领域：(1)在生物体内，甘氨酸是一些重要的小分子代谢物的合成前体，在饮食中加入适量的甘氨酸可以有效的治疗心血管疾病、炎症、肥胖、肿瘤以及糖尿病病人的代谢紊乱(2)甘氨酸是盐酸地拉普利、草甘氨酸阿司匹林钙、扑热息痛甘氨酸盐、以及利血胺注射液等多种药物合成的中间体。(3)甘氨酸作为氨基酸强化剂、调味剂、甜味剂以及抗氧化剂广泛应用于食品行业。(4)甘氨酸是合成除草剂草甘膦的前体物质，该除草剂曾被美国政府评为最优秀的农药。

目前合成甘氨酸的方法主要有氯乙酸氨解法、施特雷克法(Strecker)法、催化脱氢氧化法，辐射合成法和生物合成法等。其中的生物合成法，在此之前有利用乙醇胺为底物，在好氧土壤杆菌属、短杆菌属、棒状杆菌属等微生物的作用下转化获得，也有利用假细胞菌属、酪蛋白菌属、产碱杆菌属等菌属将甘氨酰胺水解生成甘氨酸。虽然上述方法可以实现甘氨酸的生产，但是存在原料成本较高以及酶活性较低，需要大量菌体的问题。生物转化仍需要建立一种更为廉价的原料路线。大肠杆菌作为遗传背景清晰、遗传操作简单的模式微生物，常被用来进行代谢工程改造以生产具有高附加值的代谢产物。在大肠杆菌中甘氨酸可以由丝氨酸、苏氨酸等前体得到，但鲜有以葡萄糖作为底物通过代谢工程改造合成甘氨酸的研究。

发明内容

本发明的目的是构建一种大肠杆菌重组菌，通过对重组菌的基因进行引入或敲除修饰，该重组菌可以高效将葡萄糖转化为甘氨酸。

本发明提供的大肠杆菌重组菌具有如下修饰：

一种大肠杆菌重组菌，所述菌株包括如下修饰:

1)引入外源的谷氨酸乙醛酸转氨酶基因cgaT；

2)引入外源苹果酸硫激酶基因mtk，引入外源苹果酰辅酶A裂解酶裂解酶基因mcl；

3)引入乙醛酸途径aceK基因，即异柠檬酸脱氢酶激酶/磷酸酶的基因；

4)敲除aceB基因，即苹果酸合酶A的基因；

5)敲除iclR基因，即乙醛酸途径转录抑制因子的基因；

6)敲除glcB基因，即蛋白质苹果酸合酶G的基因；

7)敲除maeA基因，即苹果酸脱氢酶(需要NAD)的基因；

8)敲除maeB基因，即苹果酸脱氢酶的基因。

本发明还提供了一种上述大肠杆菌重组菌的构建方法，其制备步骤如下：