[发明专利]一种定量检测大肠杆菌O157:H7的方法

权利要求书

1.一种定量检测大肠杆菌O157:H7的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）制备检测线包被大肠杆菌O157:H7抗体、质控线包被羊抗鼠IgG抗体的试纸条；

（2）在试纸条检测区域下方放置磁铁；

（3）脂质体的制备：采用反相蒸发法制备负载辣根过氧化物酶的脂质体，将 300μL10mg/mL 的 L-α-磷脂酰胆碱溶液与80μL3mg/mL 的结合生物素的磷酸乙醇胺溶液和 50μL4mg/mL 的胆固醇溶液充分搅拌混合，减压蒸馏以除去氯仿；然后，加入100μL 100μg/mL 的HRP 溶液涡旋混合 2 分钟；最后，经14 kDa 透析袋透析得到所需的脂质体；脂质体直径为30-100nm；

（4）金磁纳米颗粒Fe₃O₄@AuNPs表面修饰大肠杆菌O157:H7抗体，将样品溶液与修饰大肠杆菌O157:H7抗体的金磁纳米颗粒Fe₃O₄@AuNPs溶液、脂质体和亲和素溶液充分混合，室温下反应，滴加到样品垫上时，样品在毛细作用下在试纸条上流动，当移动到结合垫时，基于抗原抗体间的免疫反应，修饰抗体脂质体-Fe₃O₄@AuNPs将与样品中含有的大肠杆菌 O157:H7结合，形成脂质体-Fe₃O₄@AuNPs-抗体-目标菌复合物；层析后，加入3,3',5,5'-四甲基联苯胺和过氧化氢溶液，利用TMB-HRP间的催化氧化反应产生大量蓝色信号增强检测信号，检测出样品中低浓度的大肠杆菌 O157:H7；

还包括将样品富集预处理：将修饰大肠杆菌O157:H7抗体的Fe₃O₄@AuNPs纳米颗粒溶液加入到样品溶液中充分反应，富集样品中存在的大肠杆菌O157:H7，然后在外加磁场条件下，分离出结合大肠杆菌O157:H7的免疫磁性纳米颗粒，重新溶解在PBS溶液中。

2.根据权利要求1所述的一种定量检测大肠杆菌O157:H7的方法，其特征在于，所述的磁铁的磁场强度为100mT-500mT。

3.根据权利要求1所述的一种定量检测大肠杆菌O157:H7的方法，其特征在于，所述的试纸条包括衬板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，所述样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸由后到前依次粘贴吸附在所述衬板上，所述硝酸纤维素膜上划有一条检测线和一条质控线；所述检测线包被大肠杆菌O157:H7抗体；所述质控线包被羊抗鼠IgG抗体。

4.根据权利要求3所述的一种定量检测大肠杆菌O157:H7的方法，其特征在于，试纸条的制备方法包括以下步骤：

（1）金磁纳米颗粒的制备：合成磁性纳米颗粒Fe₃O₄，在其表面包被金壳，得到Fe₃O₄@AuNPs纳米颗粒，在Fe₃O₄@AuNPs表面修饰大肠杆菌O157:H7抗体；

（2）硝基纤维膜的处理：将大肠杆菌O157:H7抗体溶液喷涂在硝基纤维膜上形成检测线，将羊抗鼠IgG抗体溶液喷涂在硝基纤维膜上形成检测质控线，烘干，即得到处理后的硝基纤维膜；

（3）试纸条的组装：在衬板上依次搭接并粘贴处理后的样品垫、结合垫和硝酸纤维素膜，再在酸纤维素膜的一侧搭接吸水纸，组装后裁剪为60mm长，3.8mm宽的试纸条，即得到所述定量检测大肠杆菌O157:H7的免疫层析试纸条，将制得的试纸条与干燥剂一起装入避光袋密封保存待用。

5.根据权利要求3所述的一种定量检测大肠杆菌O157:H7的方法，其特征在于，大肠杆菌O157:H7单克隆抗体或多克隆抗体。