[发明专利]一种定量检测大肠杆菌O157:H7的方法

说明书

本发明涉及一种定量检测大肠杆菌O157:H7的方法，包括以下步骤：（1）制备检测线包被大肠杆菌O157:H7抗体、质控线包被羊抗鼠IgG抗体的试纸条；（2）在试纸条检测区域下方放置磁铁；（3）检测大肠杆菌O157:H7含量。通过引入“磁聚焦”策略和包埋L‑半胱氨酸的脂质体，大幅提升了免疫层析试纸条的灵敏度，解决了其灵敏度低的瓶颈问题，或使用的金磁纳米颗粒既用于在样品预处理步骤中富集大肠杆菌O157:H7，又在随后的免疫层析检测中用于构建信号探针，减少了操作步骤，降低了成本。本发明的试纸条检测限低、特异性好、成本低廉、检测时间短。

技术领域

本发明属于分析检测领域，具体涉及一种定量检测大肠杆菌O157:H7的方法。

背景技术

大肠杆菌O157:H7，是威胁人类健康的主要病原菌之一。由于其广泛存在于水和土壤中，由其引发的疾病往往人群数量多，分布广，给食品安全和人们健康带来巨大的威胁。因此，食品中大肠杆菌O157:H7的检测具有非常重要的意义。

目前常用的检测食源性致病菌的方法主要有平板计数法、聚合酶链锁反应法、环介导等温扩增法、酶联免疫吸附测定法、免疫磁性纳米颗粒分离法、荧光免疫分析法、颜色传感器等。这些检测方法通常需要对样品进行分离、纯化培养、富集，步骤繁多、实验周期长，致使整个检测过程费时费力，不能满足现场快速高通量检验的需要。

免疫层析是近年来兴起的一种新型快速检测技术。凭借其简单易用、低成本、检测快速等优势，免疫层析技术迅速得到了人们的接受和认可。随着检测技术的进步，免疫层析已经从最初的定性检测，发展到现在的半定量、定量检测。多个检测指标也可以集成在单个试纸条内，只需一次即可完成多个目标物的检测。然而，传统的基于胶体金的免疫层析技术存在灵敏度低的缺陷，极大限制了其应用的广度和商业化的可能性。因此，采用新策略克服免疫层析技术灵敏度低的瓶颈问题，对于拓展其应用范围，提高其实用性就变得尤为必要。

检测区域所能够捕获的目标物数量不足是导致传统胶体金免疫层析技术检测方法灵敏度低的关键原因。针对这一问题，目前国内外学者主要从“使检测区域的信号更容易读取”和“使检测区域能够捕获的目标物更多”两个大的方面开展研究工作。然而，目前开发出的新型免疫层析技术要么需要改变原有试纸条的构造，要么需要额外的设备或试剂，操作步骤繁琐，与免疫层析技术简捷性的优势不符，均不同程度上违背了现实生产生活中设计采用免疫层析方法的初衷。

发明内容

方法1：为了解决这一阻碍免疫层析技术应用的瓶颈，本发明中，我们从“使检测区域能够捕获的目标物更多”的角度出发，通过将经典采用的胶体金置换为磁性纳米颗粒，采用外加磁场降低其在硝基纤维膜上的移动速率的方式克服了免疫层析技术灵敏度低的缺陷。该策略把磁性纳米颗粒的高选择性、可富集性及流速可控性与免疫层析技术高通量、快速、简捷的优势相结合，大幅提高了检测灵敏度。

方法2：首先采用免疫磁性纳米颗粒富集样品溶液中的目标菌，从而达到增强最终检测灵敏度的目的。在免疫层析过程进行前，首先采用修饰大肠杆菌O157:H7抗体的Fe₃O₄@AuNPs纳米颗粒与样品溶液混合，富集样品中的大肠杆菌O157:H7。随后在外加磁场条件下，将结合大肠杆菌O157:H7的Fe₃O₄@AuNPs纳米颗粒与上清液分离，并重新溶解在PBS溶液中并将溶液用于免疫层析检测。

此外，我们从“使检测区域的信号更容易读取”的角度出发，通过引入负载辅助信号放大因子的脂质体，将传统免疫层析方法中目标物与检测信号1:1的比例关系改变为1:n，进一步提高了免疫层析技术的灵敏度。