[发明专利]高效扩增脐带血NK细胞的无血清培养方法

权利要求书

1.一种高效扩增脐带血NK细胞的无血清培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)制作第一培养基和第二培养基；

在基础培养基中添加终浓度为500～1550IU/ml的细胞因子A得到第一培养基；

在第一培养基中添加终浓度为40～80ng/ml的细胞因子B和终浓度为5％～10％的添加

物得到第二培养基；

2)抗体包被：用生理盐水稀释Herceptin至1mg/ml～2mg/ml，并加入T-75cm²培养瓶

中，置于4℃包被过夜或者室温孵育1h；

3)MNCs分离及自体血浆制备：

a)将脐带血采集至抗凝管，进行离心，吸取上层的血浆灭活得到自体血浆，下层的为脐血MNCs；

b)用羟乙基淀粉共沉淀和密度离心法分离脐血MNCs；

c)收集步骤b)中分离出的白膜层细胞，用生理盐水加2％的自体血浆洗涤二次；

4)NK细胞诱导培养：

d)将洗涤后的白膜层细胞转移至步骤2)中包被好或孵育后的T-75cm²培养瓶中，

加入第二培养基重悬细胞，调整细胞密度至大于1.5×10⁶个/ml，进行培养；

e)每隔一天补加第二培养基，调整细胞密度为2.0×10⁶个/ml，继续培养至第六天；

5)NK细胞的扩大培养：再继续培养，并在培养的第八天和第11天补加第一培养基，

且调整细胞密度为2.0×10⁶个/ml，然后再继续培养直至收获细胞；

6)NK细胞收集：培养的第14天，离心收集NK细胞，流式细胞术检测NK细胞及NKT细

胞的比例；所述步骤4)、步骤5)和步骤6)中的培养条件：温度37℃，CO₂的浓度为5％。

2.根据权利要求1所述的高效扩增脐带血NK细胞的无血清培养方法，其特征在于，步骤1)中所述的基础培养基为淋巴细胞无血清培养基；

所述淋巴细胞无血清培养基为AIM-V培养基、或GT551-H3培养基、或Alys-505NK培养基、或X-VIVO15培养基；

步骤1)中所述的细胞因子A为IL-2；

步骤1)中所述的细胞因子B为IL-15和IL-21的混合物，且IL-15与IL-21的质量比为1:1～3:1；

步骤1)中所述的添加物为自体血浆或血清替代物。

3.根据权利要求1所述的高效扩增脐带血NK细胞的无血清培养方法，其特征在于，步骤3)中的a)步骤中，灭活方法为56℃水浴30min。

4.根据权利要求1所述的高效扩增脐带血NK细胞的无血清培养方法，其特征在于，步骤3)的b)步骤中，密度离心法的离心条件为800g,时间为20min。

5.根据权利要求1所述的高效扩增脐带血NK细胞的无血清培养方法，其特征在于，步骤1)中，细胞因子A的添加浓度为1000IU/ml。

6.根据权利要求1所述的高效扩增脐带血NK细胞的无血清培养方法，其特征在于，步骤1)中细胞因子B的添加浓度为60ng/ml。

7.根据权利要求1所述的高效扩增脐带血NK细胞的无血清培养方法，其特征在于，步骤1)中添加物的浓度为5％。

8.根据权利要求1所述的高效扩增脐带血NK细胞的无血清培养方法，其特征在于，步骤2)中的T-75cm²培养瓶为悬浮细胞专用培养瓶。

9.根据权利要求1所述的高效扩增脐带血NK细胞的无血清培养方法，其特征在于，步骤3)中采集脐带血用肝素钠抗凝。

10.根据权利要求1所述的高效扩增脐带血NK细胞的无血清培养方法，其特征在于，步骤4)中洗涤后的白膜层细胞的细胞浓度为2.0×10⁶个/ml。