[发明专利]高效扩增脐带血NK细胞的无血清培养方法

说明书

本发明涉及一种高效扩增脐带血NK细胞的无血清培养方法，包括以下步骤：1)制作第一培养基和第二培养基；2)抗体包被；3)MNCs分离及自体血浆制备；4)NK细胞诱导培养；5)NK细胞扩大培养；6)NK细胞收集。本发明NK细胞扩增倍数高、纯度高、成本低、操作步骤简便，同样适用于外周血；本发明提供的分离培养方法解决了脐带血淋巴细胞难获得的问题，培养初始阶段排除了红细胞的污染，后期收获的NK细胞纯度均可达到70％以上，弥补了肿瘤病人NK细胞培养纯度低及数量不足的缺点，在同种异体NK细胞回输方面具有巨大的优势；本发明添加物和培养基配方单一，不易混淆和差错，培养流程简单，技术人员可以很容易的实施。

技术领域

本发明涉及细胞生物学技术领域，特别涉及一种高效扩增脐带血NK细胞的无血清培养方法。

背景技术

NK细胞又称自然杀伤细胞(natural killer cell,NK细胞)，是机体内重要的免疫细胞，负责杀伤老化、受病毒感染、肿瘤等异常细胞，这种天然杀伤活性无需抗原致敏，并且无MHC限制性。它能自己识别和攻击外来病毒、癌细胞和异常细胞，一旦被激活，通过释放颗粒酶和穿孔素等杀伤性介质及分泌大量细胞因子直接攻击靶细胞，或通过抗体依赖的细胞毒作用(ADCC效应)杀伤肿瘤细胞，或通过诱导Fas/Fasl和肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(Trail)分子使靶细胞凋亡。

过继免疫疗法是取对肿瘤有免疫力的供者淋巴细胞，或患者自体淋巴细胞在体外活化、扩增后，再回输入患者体内发挥抗肿瘤作用。NK细胞由于独特的抗肿瘤特点，在肿瘤免疫中的作用越来越受到重视。目前，NK细胞不仅广泛用于肿瘤病人的免疫治疗，还可应用于预防肿瘤发生。

但是NK细胞在外周血中含量很少，尤其肿瘤患者比例更低，活性较差，因此临床上多采用健康供者的血液，通过体外扩增，采用同种异体回输的方式，这就对NK细胞的数量及纯度有较高要求，不能含有过多的T细胞、B细胞等淋巴细胞。而脐带血中所含的幼稚T细胞不易引发移植物抗宿主病(GVHD)，同时脐带血中NK前体细胞多余成人外周血，因此脐带血是制备NK细胞的理想来源。

研究显示，长时间的冷冻保存并不会影响脐带血来源的NK细胞的扩增能力和抗肿瘤活性，且脐带血属于医疗废弃物，取材有保障，因此脐带血成为治疗性NK细胞很有前途的来源。然而现有技术脐带血NK细胞扩增倍数低、效应细胞比例低(纯度低)、操作复杂、需要昂贵的NK细胞培养试剂盒、生产成本高。

发明内容

本发明的目的是针对背景技术中存在的扩增倍数低、效应细胞比例低(纯度低)、操作复杂、生产成本高的问题，提供一种扩增倍数高、纯度高、操作简单、成本低的高效扩增脐带血NK细胞的无血清培养方法。

一种高效扩增脐带血NK细胞的无血清培养方法，包括以下步骤：

1)制作第一培养基和第二培养基；

在基础培养基中添加终浓度为500～1550IU/ml的细胞因子A得到第一培养基。

在第一培养基中添加终浓度为40～80ng/ml的细胞因子B和终浓度为5％～10％的添加物得到第二培养基。

2)抗体包被：用生理盐水稀释Herceptin至1mg/ml～2mg/ml，并加入T-75cm²培养瓶中，置于4℃包被过夜或者室温孵育1h。

3)MNCs分离及自体血浆制备：

a)将脐带血采集至抗凝管，进行离心，吸取上层的血浆灭活得到自体血浆，下层的为脐血MNCs。

b)用羟乙基淀粉共沉淀和密度离心法分离脐血MNCs。

c)收集步骤b)中分离出的白膜层细胞，用生理盐水加2％的自体血浆洗涤二次。

4)NK细胞诱导培养：