[发明专利]用于RPA-LFD鉴定钩吻的引物组、产品及鉴定方法与应用

权利要求书

1.一种鉴定钩吻的试剂盒，其特征在于，包括用于RPA-LFD鉴定钩吻的引物组和纤维性试纸条；

所述用于RPA-LFD鉴定钩吻的引物组包括：

Primer A如SEQ ID NO.1所示：

5’-TGTTAGAAGGAGAGGGCATTATTGCTCCTT-3’；

Primer B如SEQ ID NO.2所示：

5’-CACTTGGCTACATCCGCCCCTCTGCTCTAT-3’；

Primer B的5’端有生物素biotin标记；

LF Probe的5’端有羧基荧光素FAM标记，3’端有C3-spacer标记，序列中间有tetrahydrofuran修饰；LF Probe的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

LF Probe为：

5’-/FAM/CTAGCCTAGTATTTTATATAGAATTTTATT/tetrahydrofuran/TTTTCTTTCTCTATA/C3-spacer/-3’；

所述纤维性试纸条的制备包括：纤维性滤纸的部分采用石蜡浸泡处理，得到纤维性试纸条。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括Rehydration buffer和灭菌超纯水。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括Lysis buffer、Washbuffer、醋酸镁溶液和Running buffer中的至少一种。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，Lysis buffer包括18-22mM Tris、2.2-2.8mM EDTA、22-28mM NaCl和0.03w/v％-0.07w/v％SDS，其中，Tris和EDTA均独立地为pH7.7-8.3。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，Lysis buffer包括19-21mM Tris、2.3-2.7mM EDTA、24-26mM NaCl和0.04w/v％-0.06w/v％SDS，其中，Tris和EDTA均独立地为pH7.8-8.2。

6.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，Wash buffer包括：8-12mM Tris和0.08v/v％-0.12v/v％Tween-20，其中，Tris为pH 7.7-8.3。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，Wash buffer包括：9-11mM Tris和0.09v/v％-0.11v/v％Tween-20，其中，Tris为pH 7.8-8.2。

8.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，Running buffer包括：含0.08v/v％-0.12v/v％Tween-20的磷酸缓冲盐溶液。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，Running buffer包括：含0.09v/v％-0.11v/v％Tween-20的磷酸缓冲盐溶液。

10.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，将宽度为1.8-2.2mm和长度为4-5cm的纤维性滤纸，长度的一端1.8-2.2mm×1.8-2.2mm面积保持原样，其余部分用石蜡浸泡处理，得到纤维性试纸条。

11.一种RPA-LFD鉴定钩吻的方法，其特征在于，使用权利要求1-10任一项所述的试剂盒鉴定钩吻，包括将待检测样品利用纤维性试纸条提取得到DNA，将带有DNA的纤维性试纸条浸入RPA反应液中进行RPA反应，RPA反应后的反应液通过LFD读取结果，若为阳性反应，待检测样品为钩吻。