[发明专利]用于RPA-LFD鉴定钩吻的引物组、产品及鉴定方法与应用

说明书

本发明涉及植物领域，具体而言，提供了一种用于RPA‑LFD鉴定钩吻的引物组、产品及鉴定方法与应用。本发明针对钩吻的基因组序列设计得到特定的引物组，序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示，该引物组灵敏度和特异性好，含有该引物组的试剂和试剂盒也可以快速高效对钩吻进行鉴定，成本低。本发明对钩吻的鉴定具体包括待检测样品利用纤维性试纸条提取得到DNA，将带有DNA的纤维性试纸条浸入RPA反应液中进行RPA反应，RPA反应后的反应液通过LFD读取结果，若为阳性反应，待检测样品为钩吻。

技术领域

本发明涉及植物领域，具体而言，涉及一种用于RPA-LFD鉴定钩吻的引物组、产品及鉴定方法与应用。

背景技术

钩吻(Gelsemium elegans Benth)为马钱科钩吻属常绿木质藤本植物，因该草入口即钩人喉吻而得名，是被称为“断肠草”的近40种剧毒植物中毒性最强的。钩吻全株均有大毒，其中叶子毒性最大，5至8个叶片就足以致命。钩吻是近几年引发误食中毒最严重的物种之一，其原因主要在于钩吻植物开黄花，与药用植物金银花(Lonicera japonica Thumb)形态极为相似。金银花是一种常用中草药，始载于《名医别录》，收为上品。金银花藤煲水后对小孩湿疹等皮肤瘙痒症状有一定的治疗作用；对畜禽的多种致病的病菌、病毒有抑制作用。暑季人们常以金银花代茶，可祛暑明目，治疗温热痧痘、血痢等。金银花的分布遍布多个省份，简单易得，深受人们的喜爱。但也因此人们常常将二者混淆而误食钩吻。除此之外，还有将钩吻嫩叶与野菜混采而致人死亡，把钩吻的根当作山豆根煲凉茶喝致中毒等情况的频繁发生。据了解，服食钩吻过量可导致消化系统、循环系统和呼吸系统的强烈反应，肠发黑粘连。中毒症状包括流涎、恶心、口渴、吞咽困难、发热、呕吐、口吐白沫、抽搐、四肢麻木、肌肉无力、肌肉纤维颤动、舌硬、言语不清、烦躁不安、心律失常等，中毒晚期可引起痉挛、呼吸肌麻痹、窒息、昏迷及休克，最后甚至可因心脏衰竭或呼吸衰竭身亡。因此，建立一个快速有效鉴定剧毒植物钩吻的方法是非常有必要的。

近些年来，生物技术在中药鉴定领域得到长足发展，中药材四大传统鉴别方法无法完全保障中药材真伪鉴别的准确性，继而一系列基于基因层面、专属性较强的鉴定技术得到了发展，如DNA条形码、PCR分子鉴定技术等的广泛应用。然而，上述技术大多包含常规DNA提取和DNA梯度温度扩增的环节，极大地依赖于一系列实验室的仪器设备，并不能达到真正意义上的现场快速检测。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种用于RPA-LFD鉴定钩吻的引物组，该引物组特异性好，灵敏度高，应用于RPA-LFD方法鉴定钩吻快速高效，成本低。

本发明的第二目的在于提供引物组在制备鉴定钩吻产品中的应用。

本发明的第三目的在于提供一种鉴定钩吻的试剂或试剂盒，该试剂和试剂盒用于钩吻检测高效快速，特异性强，成本低。

本发明的第四目的在于提供RPA-LFD鉴定钩吻的方法，该方法无需使用任何仪器设备，半小时左右即可可视化得到检测结果，适合于实验室外的现场快速基因鉴定，具有快速、高效和特异性强等特点。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

用于RPA-LFD鉴定钩吻的引物组，所述引物组包括：

Primer A如SEQ ID NO.1所示：

5’-TGTTAGAAGGAGAGGGCATTATTGCTCCTT-3’；

Primer B如SEQ ID NO.2所示：

5’-CACTTGGCTACATCCGCCCCTCTGCTCTAT-3’；

LF Probe如SEQ ID NO.3所示：