[发明专利]一种基于盐酸刺激的哈维弧菌同源重组基因敲除的方法

说明书

本发明公开了一种基于盐酸刺激的哈维弧菌同源重组基因敲除的方法。将哈维弧菌作为受体菌，与供体菌进行接合转移，经同源重组实行哈维弧菌的基因敲除，所述的哈维弧菌是经过盐酸刺激处理的哈维弧菌。本发明基于盐酸刺激的哈维弧菌同源重组基因敲除的方法，该方法在传统的接合转移法的技术基础上，通过对接合受体菌哈维弧菌进行盐酸刺激处理，使得哈维弧菌的接合转化效率从无到有，发生质变，并对其加以应用，成功进行哈维弧菌同源重组基因敲除，这对未来哈维弧菌基因工程改造，研究其致病机制等，具有十分重要的意义。

技术领域

本发明属于微生物领域，具体涉及一种基于盐酸刺激的哈维弧菌同源重组基因敲除的方法。

背景技术

哈维弧菌(Vibrio harveyi)是海水养殖生物的重要条件致病菌，对海水养殖产业造成了巨大的危害。在近几年对南方养殖海水鱼病害调查中发现，海水鱼类弧菌病约90％为哈维弧菌所致，哈维弧菌的危害范围和程度已逐渐取代了溶藻弧菌和创伤弧菌，成为主要的病原弧菌。因此，阐明其致病机制并制备相关疫苗，进行免疫防控迫在眉睫。

致病机制研究以及减毒活疫苗等的研发通常涉及基因敲除的基因工程操作。但是，传统的使用大肠杆菌(Escherichia coli)宿主细菌携带外源基因，并与受体菌的接合转移实现外源载体进入细胞内，并进一步发生同源重组进行基因敲除的方法，在哈维弧菌中因大多数菌株不能成功接合转移，而受到阻碍，这限制了该菌的遗传学的研究。

发明内容

本发明针对因哈维弧菌的接合转化不成功从而难以进行基因敲除的难题，通过对接合受体菌哈维弧菌进行盐酸处理，使得哈维弧菌的接合转化效率从无到有，成功对哈维弧菌进行基因敲除，从而建立了一种提高哈维弧菌遗传转化的方法和基于盐酸刺激的哈维弧菌同源重组基因敲除的方法。

本发明的第一个目的是提供一种提高哈维弧菌遗传转化的方法，其是将哈维弧菌经过盐酸刺激处理后再用于遗传转化的受体菌。

所述的哈维弧菌是对数生长期早期的哈维弧菌。

所述的经过盐酸刺激处理是在含有哈维弧菌的培养液中加入盐酸进行刺激。

所述在含有哈维弧菌的培养液中加入盐酸进行刺激，盐酸的终浓度为0.012M～0.024M，处理5～30min，进一步优选为盐酸的终浓度为0.024M，处理5min。

本发明的第二个目的是提供一种基于盐酸刺激的哈维弧菌同源重组基因敲除的方法，将哈维弧菌作为受体菌，与供体菌进行结合转移，经同源重组实行哈维弧菌的基因敲除，其特征在于，所述的哈维弧菌是经过盐酸刺激处理的哈维弧菌。

优选，是将培养至对数早期的哈维弧菌受体菌经盐酸刺激处理后，用新鲜培养基洗涤后与培养至对数生长期早期的供体菌进行混匀，离心去上清，菌沉淀后重悬，点种至固体平板上，接合过夜，对哈维弧菌进行基因敲除。通过对接合受体菌哈维弧菌进行盐酸刺激处理，使得哈维弧菌的接合转化效率从无到有，从而对哈维弧菌进行基因敲除。

所述的经过盐酸刺激处理是在含有哈维弧菌的培养液中加入盐酸进行刺激。

所述在含有哈维弧菌的培养液中加入盐酸进行刺激，盐酸的终浓度为0.012M～0.024M，处理5～30min，进一步优选为盐酸的终浓度为0.024M，处理5min。

所述的结合转移是在28℃接合过夜。

所述的供体菌优选为携带有待缺失片段上下游同源臂的重组自杀质粒的供体菌。

本发明具有以下优点：

(1)本发明基于盐酸刺激的哈维弧菌同源重组基因敲除的方法，该方法在传统的接合转移法的技术基础上，通过对接合受体菌哈维弧菌进行盐酸刺激处理，使得哈维弧菌的接合转化效率从无到有，发生质变，并对其加以应用，成功进行哈维弧菌同源重组基因敲除，这对未来哈维弧菌基因工程改造，研究其致病机制等，具有十分重要的意义。