[发明专利]制备BEM用于纯化固定化带有AcmA重组蛋白的方法

权利要求书

1.制备BEM用于纯化固定化带有AcmA重组蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)制备带有AcmA标签的重组α-淀粉酶，作为纯化固定化酶的来源；

2)培养革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌；

3)收集菌体，利用0.1M-0.2M的HCl或TCA煮沸菌体30-60分钟；

4)离心收集沉淀，利用50mM的Tri-HCl(pH7.2)充分洗涤沉淀，得到BEM；

5)将BEM调整至相同浓度，用于纯化固定化带有AcmA标签的重组α-淀粉酶；

6)测定不同BEM纯化固定化的酶活，并进行SDS-PAGE；

7)利用8M尿素溶解包涵体，利用制备的BEM从包涵体的尿素变性中回收酶活；

8)测定不同BEM纯化固定化包涵体中的酶活，并进行SDS-PAGE。

2.根据权利要求1所述的制备BEM用于纯化固定化带有AcmA重组蛋白的方法，其特征在于，所述步骤1)培养带有质粒pET28a-α-amylase-AcmA的大肠杆菌BL21，利用IPTG诱导，收集菌体后超声破碎并离心，得到带有AcmA标签的重组α-淀粉酶，得到的上清作为可溶性的纯化固定化酶来源，沉淀作为从包涵体中回收酶活的来源。

3.根据权利要求1所述的制备BEM用于纯化固定化带有AcmA重组蛋白的方法，其特征在于，所述步骤2)利用最适培养基培养细菌，MRS培养基培养8种乳酸菌，LB培养基培养2种芽孢杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌、大肠杆菌，在最适温度下培养。

4.根据权利要求1所述的制备BEM用于纯化固定化带有AcmA重组蛋白的方法，其特征在于，所述步骤3)通过高速离心收集菌体，转速选择从4000rpm-10000rpm，温度从4℃至室温，离心10分钟至30分钟，弃上清，将菌体重悬于0.1M-0.2M的HCl或TCA中，煮沸30-60分钟。

5.根据权利要求1所述的制备BEM用于纯化固定化带有AcmA重组蛋白的方法，其特征在于，所述步骤4)利用离心收集上一步煮沸得到的沉淀，利用50mM的Tri-HCl(pH7.2)充分洗涤沉淀，得到不同细菌制备的BEM。

6.根据权利要求1所述的制备BEM用于纯化固定化带有AcmA重组蛋白的方法，其特征在于，所述步骤5)将制备得到的BEM调整至相同浓度以测定其结合能力，离心收集后弃上清，分别与步骤1)得到的上清结合以纯化固定化重组α-淀粉酶，结合时间为30-50分钟，4000rmp离心分离，用50mM的Tri-HCl(pH7.2)充分洗涤沉淀。

7.根据权利要求1所述的制备BEM用于纯化固定化带有AcmA重组蛋白的方法，其特征在于，所述步骤6)将上一步纯化固定化的酶测定酶活，利用DNS法测定酶活；将不同BEM纯化固定化的酶进行SDS-PAGE。

8.根据权利要求1所述的制备BEM用于纯化固定化带有AcmA重组蛋白的方法，其特征在于，所述步骤7)利用8M尿素溶解步骤1)得到的包涵体，充分溶解后12000rpm离心，取上清与制备的BEM混匀，室温下结合20-50分钟，12000rpm离心分离，取沉淀，利用50mM的Tri-HCl(pH7.2)充分清洗以去除非特异性结合和尿素，将结合有重组蛋白的BEM重悬于50mM的Tri-HCl(pH7.2)中，4℃过夜复性。

9.根据权利要求1所述的制备BEM用于纯化固定化带有AcmA重组蛋白的方法，其特征在于，所述步骤8)利用DNS法测定酶活，将不同BEM纯化固定化的酶进行SDS-PAGE。