[发明专利]制备BEM用于纯化固定化带有AcmA重组蛋白的方法

说明书

本发明公开了一种利用GEM去除重组蛋白内毒素的方法，它涉及一种去除大肠杆菌表达重组蛋白中内毒素的方法，蛋白‑AcmA融合蛋白重组表达载体，诱导表达后利用GEM(革兰氏阳性基质)进行纯化固定化，然后利用Triton X‑114处理固定化蛋白以去除内毒素。该方法可以在低温(4℃)下进行内毒素的去除工作，避免温度改变影响蛋白活性，并简化去除内毒素操作。

技术领域

本发明涉及一种利用细菌菌体制备新型材料BEM用于纯化固定化带有AcmA的重组蛋白的方法。

背景技术

酶的固定化对于酶的应用具有重要意义，通过固定化，可以使昂贵的酶得到回收利用，同时能够避免在反应体系中引入新的蛋白杂质。酶的固定化被广泛应用于工业催化、发酵、食品等领域。用于固定化的酶可以利用产酶菌株发酵，从天然产物中分离纯化，也可以通过重组表达来得到。重组表达可以提高酶的产量，通过添加适当标签，可以进行亲和层析等方法进行纯化。这些方法需要多步进行，同时也需要一些化学试剂如硫酸铵、咪唑等。因此这些方法存在着周期长、酶活损失等缺点。

细菌可以产多种天然产物，包括细菌素、胞外多糖、酶等。多种细菌被分离筛选以用于生产各种产物。在产完天然产物以后，大量的细菌菌体需要被处理。部分乳酸菌和芽孢杆菌可以作为益生菌应用，但是野生菌需要经过大量的工作才有可能被用于益生菌。需要为细菌的菌体寻找利用的方法。

细菌细胞壁的主要组分是肽聚糖，包括革兰氏阳性菌和阴性菌，其区别之一就是肽聚糖含量的高低。乳酸乳球菌的肽聚糖水解酶AcmA的C端的蛋白锚定域可以与肽聚糖特异的结合。利用这个特性，通过酸煮沸细菌(包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌)可以得到无生命的细菌增强基质(Bacterial enhancer matrix particles，BEM)。BEM可以用于纯化固定化带有AcmA标签的重组蛋白。

发明内容

本方法的目的在于提供一种制备BEM用于纯化固定化带有AcmA重组蛋白的方法，解决现有技术中纯化固定化带有AcmA的重组蛋白方法存在着周期长、酶活损失的问题。

本发明一种利用细菌菌体制备新型材料BEM用于纯化固定化带有AcmA的重组蛋白的方法，按照以下步骤进行：

1)制备带有AcmA标签的重组α-淀粉酶，作为纯化固定化酶的来源(可溶性酶及包涵体)；

2)培养革兰氏阳性细菌(包括乳酸菌、芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌等)、革兰氏阴性细菌(大肠杆菌、沙门氏菌)；

3)收集菌体，利用0.1M-0.2M的HCl或TCA煮沸菌体30-60分钟；

4)离心收集沉淀，利用50mM的Tri-HCl(pH7.2)充分洗涤沉淀，得到BEM；

5)将BEM调整至相同浓度，用于纯化固定化带有AcmA标签的重组α-淀粉酶；

6)测定不同BEM纯化固定化的酶活，并进行SDS-PAGE；

7)利用8M尿素溶解包涵体，利用制备的BEM从包涵体的尿素变性中回收酶活；

8)测定不同BEM纯化固定化包涵体中的酶活，并进行SDS-PAGE。

在步骤1)中，培养带有质粒pET28a-α-amylase-AcmA的大肠杆菌BL21，利用IPTG诱导，收集菌体后超声破碎并离心，得到带有AcmA标签的重组α-淀粉酶，得到的上清作为可溶性的纯化固定化酶来源，沉淀作为从包涵体中回收酶活的来源。

在步骤2)中，利用最适培养基培养细菌，MRS培养基培养乳酸菌(8种)，LB培养基培养芽孢杆菌(2种)、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌、大肠杆菌。在最适温度下培养。