[发明专利]一种去除核糖体RNA的反转录引物池、试剂盒及去除核糖体RNA的方法

说明书

本发明公开了一种去除核糖体RNA的反转录引物池、试剂盒及去除核糖体RNA的方法；该反转录引物池的序列如SEQ ID NO：1～8所示；该试剂盒包含上述反转录引物池，本发明利用植物共有的rRNA序列，设计不同密度覆盖的反转录引物，根据具体需要去除的RNA中本身的rRNA序列的差异，进行特异性的反转录，从而得到与目标RNA完全反向互补的cDNA序列，再通过后续的RNase H和DNase I特异性消化杂合链的rRNA和cDNA，最终去除核糖体RNA；该方法能够搭配建库试剂盒，最终得到浓度足够高的转录组文库，从而有效实现转录组测序在基础研究、临床诊断和药物研发等领域的广泛应用。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地，涉及一种去除核糖体RNA构建转 录组测序文库的反转录引物池、试剂盒，以及去除核糖体RNA的方法。

背景技术

随着现代科学技术的发展，生命科学的研究已经进入了组学时代。基因 和基因组测序技术已经成为现代生命科学研究，特别是基因组学研究中不可 或缺的手段。近年来新一代基因组测序技术突飞猛进的发展带来了基因组学 研究的空前繁荣。新一代测序技术已经在生命科学各个领域及农学、医学、 环境保护、法医等领域中得到广泛的应用。随着新一代高通量测序技术的快 速发展，转录组测序已经成为研究转录组与基因表达的重要手段。转录组是 指单个生物物种的个体，或者该个体的特定组织或特定细胞类型，在特定的环境条件下，或者实验处理条件下所产生的所有转录本的集合。各种类型的 转录本都可以通过新一代测序技术进行高通量定量检测，这项技术被称为转 录组测序。转录组测序技术可以用作转录本的结构及其变异、基因表达水平、 非编码区域功能和低丰度全新转录本发现等各方面的研究上。通过对转录组 的研究，人们能够从生物的整体水平上研究基因结构及其基因功能。转录组 测序已被广泛应用于遗传学、农学和医学基础研究、医疗诊断和药物研发等 领域中。

核糖体RNA(rRNA)构成细胞RNA含量的绝大部分，其占细胞内RNA 含量的约80％～95％。高丰度的rRNA使样本中其他相关的目标分子的分析 复杂化，如转录组测序(RNA-seq)分析、微阵列的基因表达分析等；尤其 在目标分子含量较少的研究中，rRNA成为巨大的背景污染。因此，通常在构 建RNA文库(例如构建转录组文库时)，需要对总RNA进行mRNA(比例 约为10％)纯化处理。

转录组测序能全面快速地获得某一物种特定组织或器官在特定状态下的 几乎所有转录本序列信息，是研究基因表达调控的主要手段。转录组测序中 样品是来源于细胞和组织中经分离的总RNA，包括mRNA、rRNA、tRNA、 LncRNA和小RNA等。对于转录组分析中的目标RNA(mRNA和LncRNA)，rRNA的数据属于冗余信息，在转录组测序中的RNA文库构建中，首先会进 行rRNA的去除，再进行常规的RNA建库。

现有的用于去除rRNA，进行转录组文库构建的试剂盒，主流的试剂盒使 用RNA探针结合链霉亲和素磁珠方法去除rRNA，如Illumina的 Stranded Total RNA LT-(with Ribo-Zero TM Plant)，其试剂盒的探针为外源性 合成，价格昂贵，而且只能基于1-2个物种进行设计，其他种属的物种甚至 亚种未能保证其去除效率，而且总RNA起始量为100ng-1ug，对于总RNA 起始量为1ng-100ng的样品，暂未有能有效去除其rRNA、进行转录组文库构 建的试剂盒。这一限制可能导致试剂盒标注物种以外的其他植物物种，或者 低起始样品来源的转录组测序文库构建中存在严重的rRNA残留、数据冗余， 从而影响后续的mRNA或LncRNA的检出与分析。最后，由于本发明使用的 方法是特异性的反转录引物结合后，特异性的扩增对应物种的rRNA，并且利 用双酶进行酶解消除，因此不受物种间rRNA序列局部差异的影响，原理上 能应用于植物源性的其他物种的核糖体去除，实现了不同物种来源的RNA都 使用同一套引物进行实验的目的。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术存在的上述缺陷，提供一 种构建转录组测序文库前，用于去除核糖体RNA的反转录引物池。