[发明专利]一种维生素A代谢相关基因突变位点的检测方法

权利要求书

1.一种维生素A代谢相关基因突变位点的检测方法，其特征在于，通过设计的目标位点特异性引物的单管多重PCR扩增反应得到目标片段，目标片段经过限制性内切酶消化，然后再利用单碱基延伸技术对经过限制性内切酶消化的目标片段进行双向延伸，得到待检基因位点，最后通过核酸质谱分析精确测定目标DNA序列；

其中，所述单碱基延伸技术是采用单碱基延伸引物组对所述目标片段进行双向延伸。

2.根据权利要求1所述的维生素A代谢相关基因突变位点的检测方法，其特征在于，所述目标位点特异性引物包括：

用于扩增维生素A代谢相关基因BCM01-RS6420424片段的第一特异性引物，第一特异性引物的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID Nos：1所示，第一特异性引物的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID Nos：2所示；

用于扩增维生素A代谢相关基因BCM01-RS11645428片段的第二特异性引物，第二特异性引物的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID Nos：3所示，第二特异性引物的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID Nos：4所示；

用于扩增维生素A代谢相关基因BCM01-RS6564851片段的第三特异性引物，第三特异性引物的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID Nos：5所示，第三特异性引物的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID Nos：6所示。

3.根据权利要求1所述的维生素A代谢相关基因突变位点的检测方法，其特征在于，所述单碱基延伸技术所用的引物包括：

用于扩增维生素A代谢相关基因BCM01-RS6420424片段的第一单碱基延伸引物，第一单碱基延伸引物的核苷酸序列如SEQ ID Nos：7所示；

用于扩增维生素A代谢相关基因BCM01-RS11645428片段的第二单碱基延伸引物，第二单碱基延伸引物的核苷酸序列如SEQ ID Nos：8所示；

用于扩增维生素A代谢相关基因BCM01-RS6564851片段的第三单碱基延伸引物，第三单碱基延伸引物的核苷酸序列如SEQ ID Nos：9所示。

4.根据权利要求3所述的维生素A代谢相关基因突变位点的检测方法，其特征在于，在第一单碱基延伸引物的5`端、第二单碱基延伸引物的5`端以及第三单碱基延伸引物的5`端均加入10个核苷酸，10个核苷酸的固定序列为ACGTTGGATG。

5.根据权利要求1或4所述的维生素A代谢相关基因突变位点的检测方法，其特征在于，所述单管多重PCR扩增的反应程序为：95℃2分钟，95℃30秒，56℃20秒，72℃60秒，45循环，72℃5分钟，4℃保温。

6.根据权利要求1所述的维生素A代谢相关基因突变位点的检测方法，其特征在于，所述限制性内切酶为虾碱性磷酸酶。

7.根据权利要求1所述的维生素A代谢相关基因突变位点的检测方法，其特征在于，所述限制性内切酶消化处理的程序为：37℃消化处理45分钟，85℃加热变性5分钟，冰浴10分钟。

8.根据权利要求1所述的维生素A代谢相关基因突变位点的检测方法，其特征在于，所述双向延伸反应的程序为：94℃30秒；94℃5秒，52℃5秒，80℃5秒，5个循环，40个循环；72℃3分钟，4℃保温。

9.根据权利要求1或8所述的维生素A代谢相关基因突变位点的检测方法，其特征在于，所述核酸质谱分析的具体步骤为：

所述核酸质谱分析的具体步骤为：

S1：在树脂板上铺好待用树脂，风干3-8分钟；

S2：向样本板的反应孔中加入待测的样本，补充41μL ddH₂O，用封口膜密封，3000rpm/min，瞬时离心；

S3：除去封口膜，将样本板倒扣在步骤S1中的树脂板上固定，然后将样本板和树脂板一起翻转，使风干的树脂落入样本板的反应孔内，用封口膜密封，3000rpm/min，瞬时离心；

S4：将步骤S3中的样本板置于旋转器上在800rpm/min的转速下旋转30分钟，在3000rpm/min，离心5分钟，然后点样上机，用核酸质谱仪进行检测。