[发明专利]从临床血液中检测单核细胞增生李斯特菌病原菌的方法

权利要求书

1.一种从临床血液中检测单核细胞增生李斯特菌病原菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、血液中单核细胞增生李斯特菌基因组DNA的提取；

S2、血液中单核细胞增生李斯特菌PCR检测：

S2.1、利用单核细胞增生李斯特菌基因组DNA序列设计一段特异性的PCR引物，该特异性的PCR引物包括如SEQ ID NO.1所示的正向引物和SEQ ID NO.2所示的反向引物；其中，

SEQ ID NO.1：5’-GGGAAATCTGTCTCAGGTGATGT-3’；

SEQ ID NO.2：5’-CGATGATTTGAACTTCATCTTTTGC-3’；

引物所扩增的目的片段长度为106bp；

S2.2、以步骤S1中从血液中提取的单核细胞增生李斯特菌基因组DNA为模板，采用步骤S2.1中的特异性的PCR引物进行PCR扩增；

S2.3、对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳及检测，扩增出长度为106bp的片段则判定为检测出单核细胞增生李斯特菌病原菌。

2.根据权利要求1所述的从临床血液中检测单核细胞增生李斯特菌病原菌的方法，其特征在于，步骤S2.2中，PCR扩增时，PCR的反应体系为：2倍Flash Hot Start Master Mix 5μL，2μmol/L的正向引物1μL，2μmol/L的反向引物1μL，基因组DNA模板1μL，双蒸水补足至10μL；

PCR的反应程序为：98℃预变性2min；98℃变性5s，50℃退火10s，72℃延伸5s，30次循环；最后72℃延伸7min，16℃保存。

3.根据权利要求1所述的从临床血液中检测单核细胞增生李斯特菌病原菌的方法，其特征在于，步骤S2中，提供单核细胞增生李斯特菌基因组DNA提取的菌含量≥10CFU/mL。

4.根据权利要求1所述的从临床血液中检测单核细胞增生李斯特菌病原菌的方法，其特征在于，步骤S1中，血液样品中单核细胞增生李斯特菌病原菌基因组DNA的提取具体包括以下步骤：

S1.1、血液样品与酶裂解液等体积混合混匀，37℃孵育15分钟；

S1.2、步骤S1.1中酶裂解液处理的血液样品与碱裂解液等体积混合，轻轻混匀，室温静置裂解5分钟；

S1.3、步骤S1.2中裂解处理后的血液样品与去杂液体按积比为2：1混合，加入去杂液后立即混匀直至出现沉淀，放置离心机中室温12000转/分钟离心10分钟；

S1.4、轻轻吸取上层悬液至DNA吸附柱中，并将DNA吸附柱套在2mL离心管内；12000转/分钟离心1分钟，去除离心管内的废液，将2mL离心管重新套入DNA吸附柱；

S1.5、向DNA吸附柱内加入500μL的0.4M KI与异丙醇混合液；12000转/分钟离心1分钟，去除离心管内的废液，将2mL离心管重新套入DNA吸附柱；

S1.6、再向DNA吸附柱内加入700μL的80％v/v无水乙醇和10mM pH8.0的Tris-HCl混合液；12000转/分钟离心1分钟，去除离心管内的废液，将2mL离心管重新套入DNA吸附柱；

S1.7、重复步骤S1.6 1次；

S1.8、空DNA吸附柱12000转/分钟离心5分钟，并将DNA吸附柱转移至1.5mL离心管内；

S1.9、向空DNA吸附柱膜中央加入30μL 10mM Tris-HCl和1mM EDTA混合液，pH为8.0-8.5；12000转/分钟离心2分钟，收集洗脱下来的基因组DNA。

5.根据权利要求4所述的从临床血液中检测单核细胞增生李斯特菌病原菌的方法，其特征在于，步骤S1.1中，酶裂解液中含有：0.1mg/mL核糖核酸酶A、1mg/mL蛋白酶K、0.05mg/mL广谱裂解酶、10mg/mL溶菌酶、25mM Tris-HCl、10mM EDTA，pH 8.0-8.5。

6.根据权利要求4所述的从临床血液中检测单核细胞增生李斯特菌病原菌的方法，其特征在于，步骤S1.2中，碱裂解液中含有：0.2M NaOH，1％SDS，pH 12-14。

7.根据权利要求4所述的从临床血液中检测单核细胞增生李斯特菌病原菌的方法，其特征在于，步骤S1.3中，去杂液中含有：4M NH₄Ac-HAc，pH 4.5-4.8。